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1 - SYSTÈMES D'EXPRESSION DES PROTÉINES RECOMBINANTES UTILISÉS EN BIOTECHNOLOGIE : AVANTAGES ET INCONVÉNIENTS

2 - ASPECTS QUALITATIFS DES PROTÉINES RECOMBINANTES

3 - N-GLYCOSYLATION DES PROTÉINES DANS LES CELLULES ANIMALES

Article de référence | Réf : BIO6200 v1

N-glycosylation des protéines dans les cellules animales
Procédés de production de protéines recombinantes thérapeutiques : vers une maîtrise de la glycosylation

Auteur(s) : Jean-Louis GOERGEN, Emmanuel GUEDON, Marie-Françoise CLINCKE

Date de publication : 10 mai 2011

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RÉSUMÉ

Les protéines recombinantes sont produites par des cellules dont l’ADN a été modifié par recombinaison génétique. Le système d'expression utilisé peut être de plusieurs types, organisme unicellulaire (procaryote ou eucaryote) ou pluricellulaire (plantes et animaux transgéniques). Malgré de fortes concentrations de protéines produites et de faibles contraintes de mise en œuvre, les systèmes d'expression bactériens n'autorisent pas les modifications posttraductionnelles et la glycosylation. Par contre, les cellules de mammifère se sont progressivement imposées comme les hôtes d'expression de choix pour la production de protéines recombinantes complexes d'intérêt thérapeutique. La description des mécanismes cellulaires impliqués dans la glycosylation des protéines, des différents modes de production ainsi que du choix des paramètres opératoires représente un socle de connaissances essentielles à la mise en œuvre de nouveaux procédés de production.

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ABSTRACT

Production methods of recombinant proteins; towards mastering glycosylation

Recombinant proteins are produced by cells the DNA of which has been modified by genetic recombination. The expression system involved can be single-cell (procaryotic or eucaryotic) or pluricellular organisms (transgenic plants and animals). Despite high concentrations of produced proteins and low implementation constraints, bacterial expression systems do not allow for post-translational modification and glycosylation. However, mammalian cells have gradually become the most favored expression systems in order to achieve the production of complex recombinant proteins of therapeutic interest. Sound knowledge of the cellular mechanisms involved in protein glycosylation, various production modes as well as in the choice of operating parameters is essential in order to achieve the implementation of new production processes.

Auteur(s)

  • Jean-Louis GOERGEN : Professeur à l'Institut national polytechnique de Lorraine (INPL) - École nationale supérieure d'agronomie et des industries alimentaires (ENSAIA)

  • Emmanuel GUEDON : Chargé de recherche CNRS - Laboratoire réactions et génie des procédés (LRGP)

  • Marie-Françoise CLINCKE : Doctorante à l'Institut national polytechnique de Lorraine (INPL)

INTRODUCTION

En 2009, plus de 150 protéines recombinantes, dites « biopharmaceutiques », ont obtenu une autorisation de mise sur le marché délivrée par la Food and Drug Administration (FDA) et l'European Agency for the Evaluation of Medicinal Products (EMEA). Parmi ces protéines, 76 ont été produites à partir de cellules de mammifère. Nonobstant des concentrations de protéines produites largement supérieures et des contraintes de mise en œuvre beaucoup moins importantes, les systèmes d'expression bactériens n'autorisent pas les modifications posttraductionnelles (MPT) complexes, contrairement aux cellules animales et de mammifère en particulier. Parmi ces MPT, la glycosylation est la plus importante ; elle est présente sur plus de 50 % des protéines chez l'homme et confère aux protéines qui les portent des propriétés fonctionnelles, structurales et pharmaco-cinétiques. Alors que la glycosylation n'est pas assurée avec les systèmes bactériens ou l'est partiellement par les levures ou les cellules d'insecte, les cellules de mammifère et plus particulièrement la cellule CHO se sont progressivement imposées comme les hôtes d'expression de choix pour la production de protéines recombinantes complexes d'intérêt thérapeutique. Outre la glycosylation, la production de protéines par ce système cellulaire présente l'avantage de pouvoir généralement assurer d'autres MPT importantes, parmi lesquelles la sulfatation ou encore la protéolyse.

L'objectif de cet article est de décrire, après quelques généralités, les différents systèmes cellulaires utilisés par l'industrie des biotechnologies ainsi que les principales caractéristiques qualitatives des protéines recombinantes. L'accent est tout particulièrement porté sur les modifications posttraductionnelles et en premier lieu la glycosylation. La description des mécanismes cellulaires impliqués dans la glycosylation des protéines, des différents modes de production ainsi que du choix des paramètres opératoires représente un socle de connaissances essentielles à la mise en œuvre de nouveaux procédés de production ou à l'amélioration ciblée de procédés déjà existants.

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DOI (Digital Object Identifier)

https://doi.org/10.51257/a-v1-bio6200


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3. N-glycosylation des protéines dans les cellules animales

3.1 Biosynthèse des glycoprotéines dans les cellules animales

L'assemblage des glycoprotéines est effectué, dans un premier temps, dans le réticulum endoplasmique (RE) puis, dans un second temps, dans l'appareil de Golgi. Les glycoprotéines sont en règle générale des protéines sécrétées, membranaires ou résidentes de ces deux compartiments, ce qui implique qu'elles possèdent une séquence signal gouvernant leur translocation vers le RE.

La synthèse d'une N-glycosylprotéine requiert l'élaboration préalable d'un glycanne constitué de quatorze monosaccharides sur un lipide de type polyisoprénique intégré dans la membrane du RE, le dolichol phosphate (Dol-P). L'assemblage de l'oligosaccharide s'effectue de manière séquentielle par l'intermédiaire d'un cycle métabolique bien particulier appelé le « cycle des dolichols » .

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3.1.1 Précurseurs nucléotidiques

Pour être transférés sur une protéine par l'intermédiaire d'une glycosyltransférase, les monosaccharides doivent au préalable être activés sous la forme de nucléotides-sucres. Seules des enzymes du RE ont pour substrat un monosaccharide lié à un lipide : le mannosyl phosphodolichol (Man-Dol-P), synthétisé à partir du GDP-Man.

Le tableau 11 répertorie les formes activées des principaux monosaccharides utilisés dans le processus de glycosylation. À l'exception des acides N-acétylneuraminiques (Neu5Ac) et N-glycolylneuraminiques (Neu5Gc) liés à un nucléotide monophosphate, tous les autres monosaccharides sont liés à un nucléotide diphosphate.

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3.1.2 Glycosyltransférases

Le...

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BIBLIOGRAPHIE

  • (1) - BANEYX (F.), MUJACIC (M.) -   Recombinant protein folding and misfolding in Escherichia coli.  -  Nat. Biotechnol., no 22, p. 1399-1407 (2004).

  • (2) - KANE (J.F.), HARTLEY (D.L.) -   Formation of recombinant protein inclusion bodies in Escherichia coli.  -  Trends Biotechnol., no 6, p. 95-101 (1988).

  • (3) - TRAN-MOSEMAN (A.), SCHAUER (N.) et DE BERNARDEZ CLARK (E.) -   Renaturation of Escherichia coli – derived recombinant human macrophage colony-stimulating factor.  -  Protein Express Purif., no 16, p. 181-189 (1999).

  • (4) - CHIBA (Y.) et JIGAMI (Y.) -   Production of humanized glycoproteins in bacteria and yeasts.  -  Curr. Chem. Biol., no 11, p. 670-676 (2007).

  • (5) - HAMILTON (S.R.), BOBROWICZ (P.), BOBROWICZ (B.), DAVIDSON (R.C.), LI (H.), MITCHELL (T.), NETT (J.H.), RAUSCH (S.), STADHEIM (T.A.) et al -   Production of complex human glycoprotein in yeast.  -  Science, no 301, p. 1244-1246 (2007).

  • ...

ANNEXES

  1. 1 Annuaire

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    Alexion http://www.alxn.com/

    Amgen http://www.amgen.fr

    Bayer, Inc. http://www.bayer.com/

    Biogen Idec http://www.biogenidec.fr/

    BioProtein Technologies http://www.bioprotein.com/fr/

    Bristol-Myers Squibb http://www.bmsfrance.fr

    Biowa-Kyowa http://www.biowa.com/

    Centocor http://www.centocororthobiotech.com

    Crucell https://www.janssen.com/fr/infectious-diseases-and-vaccines/crucell

    Dow AgroSciences http://www.dowagro.com/fr/

    Eli Lilly http://www.lilly.com

    Genentech http://www.gene.com

    Genzyme France http://www.genzyme.fr/

    GlycoFI http://www.glycofi.com

    GSK http://www.gsk.fr

    GTC Biotherapeutics http://www.gtc-bio.com

    Hoffmann-La Roche http://www.roche.fr

    Johnson http://www.jnj.com

    Laboratoire français du Fractionnement et des Biotechnologies (LFB) http://www.lfb.fr

    Merk et Co http://www.merck.com

    Plant Advanced Technologies (PAT SA) http://www.plantadvanced.com/

    Protein Sciences Corp. http://www.proteinsciences.com...

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