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Séquençage à haut débit - Outils et enjeux pour la santé humaine| Réf : RE281 v1
Auteur(s) : Jasmina VIDIC, Sandrine AUGER
Date de publication : 10 déc. 2019
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Les méthodes conventionnelles de détection des bactéries basées sur la croissance et le dénombrement bactérien sont à la base des protocoles officiels utilisés par les professionnels et dans les laboratoires de recherche.
Les protocoles basés sur la culture bactérienne sont sensibles et sélectifs mais leur temps d’analyse est long et le coût élevé. Plusieurs étapes sont nécessaires : après l’homogénéisation des échantillons, les bactéries sont revivifiées et multipliées dans l’étape d’enrichissement, puis les bactéries d’intérêt sont sélectionnées sur des milieux d’agar sélectifs. Des tests biochimiques complémentaires peuvent ensuite être appliqués pour identifier et valider précisément l’espèce bactérienne. Le procédé nécessite des milieux spécifiques pour l’enrichissement, l’isolement et l’identification de chaque microorganisme recherché. Plusieurs milieux de culture de composition définie, un grand nombre de boîtes de Pétri, de supports, de matières plastiques, une atmosphère avec la teneur en oxygène adaptée et des températures d’incubation optimisées sont nécessaires pour la croissance des différentes souches bactériennes. Le résultat de la sélection et du dénombrement bactérien est obtenu après au moins cinq jours, voire une semaine pour déterminer avec succès la contamination par des agents pathogènes présents en faible nombre dans un échantillon alimentaire.
la méthode officielle ISO 11290 pour la détection de L. monocytogenes repose sur deux étapes d’enrichissement dans un milieu avant l’étalement bactérien sur la gélose sélective, suivies d’un test moléculaire de confirmation.
D’autres méthodes sont proposées pour le dénombrement des bactéries vivantes, notamment la dilution en séries de cultures bactériennes. Cette méthode est laborieuse car elle nécessite 3 à 5 répétitions pour chaque dilution afin d’obtenir des résultats significatifs et fiables. De manière générale, les méthodes de dénombrement bactérien peuvent produire des résultats faux-négatifs car certains traitements utilisés par l’industrie alimentaire (salage, traitement thermique, ajout d’agents...
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BIOPROCÉDÉS
(1) - DING (T.), SUO (Y.), ZHANG (Z.), LIU (D.), YE (X.), CHEN (S.), ZHAO (Y.) - A multiplex RT-PCR assay for S. aureus, L. monocytogenes, and Salmonella spp. Detection in raw milk with pre-enrichment. - Frontiers in Microbiology, 8, p. 989 (2017).
(2) - MARGOT (H.), ZWIETERING (M.H.), JOOSTEN (H.), O’MAHONY (E.), STEPHAN (R.) - Evaluation of different buffered peptone water (BPW) based enrichment broths for detection of Gram-negative foodborne pathogens from various food matrices. - International Journal of Food Microbiology, 214, p. 109-115 (2015).
(3) - TSE (C.), CAPEAU (J.) - In real time PCR methodology for quantification of nucleic acids. - Annales de biologie clinique, 2003 , p. 279-293 (2003).
(4) - RODRÍGUEZ-LÁZARO (D.), COOK (N.), HERNÁNDEZ (M.) - Real-time PCR in food science : PCR diagnostics. - Current Issues Molecular Biology, 15, p. 39-44 (2013).
(5) - PAN (Y.), BREIDT (F.) - Enumeration of viable Listeria monocytogenes cells by real-time PCR with propidium monoazide and ethidium...
Méthodes horizontales dans le domaine de l’analyse microbiologique de la chaîne alimentaire, du stade de production primaire aux produits pour l’alimentation humaine et animale, y compris l’environnement de la production et de la manutention des produits alimentaires - ISO/TC 34/SC 9 - 2016
Microbiologie des aliments – Exigences générales et recommandation - ISO 7218 - 2007
Microbiologie de la chaîne alimentaire – Méthode horizontale pour la recherche et le dénombrement de Listeria monocytogenes et de Listeria spp. - ISO 11290 - 2017
Produits alimentaires – Méthodes d’analyse pour la détection des organismes génétiquement modifiés et des produits dérivés – Extraction des acides nucléiques - ISO 21571 - 2005
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