Électrophorèse : définition et principe

Le principe : une course dont la vitesse dépend du rapport charge sur taille

Une molécule portant une charge nette placée dans un champ électrique se déplace vers l'électrode de signe opposé. Elle subit deux forces antagonistes : la force électrique, proportionnelle à sa charge, et la force de frottement visqueux, qui croît avec sa taille et dépend de sa forme. L'équilibre entre les deux s'établit presque instantanément, si bien que la molécule migre à vitesse constante. Cette vitesse rapportée au champ appliqué s'appelle la mobilité électrophorétique, et c'est elle que la méthode mesure réellement.

Deux molécules chargées de même charge mais de masse différente ne migrent donc pas à la même vitesse ; deux molécules de même taille mais de charges distinctes non plus. C'est ce qui permet de séparer les composés d'un mélange complexe sans les transformer chimiquement. Le pH du tampon reste le paramètre le plus déterminant : il fixe l'état d'ionisation des groupements acides et basiques, donc la charge nette de chaque espèce. Toute mobilité mesurée n'a de sens qu'en fonction du tampon dans lequel elle a été obtenue.

De là découle la notion de point isoélectrique, ou pHi, valeur de pH à laquelle la charge nette d'une molécule amphotère s'annule. À ce pH précis, la molécule s'arrête, quelle que soit l'intensité du champ. L'isoélectrofocalisation exploite directement ce blocage : dans un gradient de pH immobilisé, chaque protéine avance jusqu'à la zone où son pH isoélectrique est atteint, puis s'y concentre en une bande fine.

Les grands montages et leurs supports

Le champ électrique reste le même partout. D'une méthode à l'autre, seul change le milieu dans lequel la migration a lieu.

• L'électrophorèse sur gel de polyacrylamide sépare les protéines. Le gel est un réseau dont les pores sont calibrés par le taux de réticulation : plus il est serré, plus l'effet de tamisage moléculaire s'ajoute à l'effet de charge. En conditions dénaturantes, le SDS enrobe la protéine d'une charge négative proportionnelle à sa longueur, ce qui annule la contribution de la charge propre et fait migrer chaque chaîne selon sa seule masse moléculaire.
• L'électrophorèse sur gel d'agarose sépare les acides nucléiques, dont la charge est déjà proportionnelle à la longueur. Les gels les plus dilués résolvent les grands fragments, les plus concentrés les petits.
• L'électrophorèse capillaire remplace le gel par un tube de silice de quelques dizaines de micromètres. Le faible diamètre évacue la chaleur, ce qui autorise des champs très élevés, donc des séparations en 5 à 10 minutes avec une efficacité que le gel n'atteint pas.
• L'électrophorèse bidimensionnelle croise deux critères : isoélectrofocalisation selon le pHi dans un sens, migration en SDS selon la masse dans l'autre. Elle résout plusieurs milliers de protéines séparées sur un même gel.

L'électrophorèse préparative se distingue des précédentes par sa finalité : récupérer la fraction séparée plutôt que l'observer. Son dimensionnement et ses différentes mises en œuvre sont traités dans électrophorèse préparative. Le principe de la variante capillaire est exposé dans électrophorèse capillaire, principe, son appareillage et ses applications faisant l'objet d'articles distincts.

Révélation et lecture des résultats

Une migration ne produit aucun signal. Les bandes restent invisibles tant qu'une étape de révélation ne les a pas marquées, et le choix du marquage détermine ce qu'on pourra en tirer. Le bleu de Coomassie reste le plus simple, quantitatif sur une gamme étroite. La coloration à l'argent descend beaucoup plus bas en sensibilité, mais sature vite. Les marquages fluorescents offrent la plage de linéarité la plus large, au prix d'un imageur dédié.

Le transfert sur membrane change de logique. Après migration, les protéines sont transférées puis reconnues par des anticorps dirigés contre une cible unique : on ne révèle plus toutes les bandes mais la seule espèce recherchée, dont on confirme à la fois la présence et la masse apparente. Le même raisonnement s'applique aux acides nucléiques avec des sondes complémentaires, comme le détaille l'analyse des acides nucléiques.

Une précaution vaut pour toute lecture de résultats : une position de bande ne donne une masse qu'après étalonnage par un marqueur de masses connues déposé sur le même gel, et la relation reste approchée pour les protéines glycosylées ou très basiques. En capillaire, la détection se fait en ligne, par absorption ultraviolette ou par fluorescence le plus souvent ; la grandeur lue est alors un temps de migration, à étalonner de la même manière.

Ce que l'électrophorèse permet de faire, en laboratoire et en production

En biologie et en analyse, la méthode vérifie la pureté d'un lot, estime une masse moléculaire, contrôle l'intégrité d'un échantillon d'acide nucléique, compare des profils d'une condition à l'autre. Ces utilisations tiennent à un même avantage : une résolution élevée pour un coût de consommables dérisoire.

En santé, l'électrophorèse des protéines sériques reste un examen de routine : selon la forme des fractions, le profil obtenu oriente vers une inflammation, un déficit ou une immunoglobuline monoclonale, et c'est ce dessin d'ensemble, jamais une fraction prise isolément, que le biologiste interprète. L'électrophorèse de l'hémoglobine sert de la même façon au diagnostic des hémoglobinopathies. Le résultat naît de la comparaison à un profil de référence.

En contrôle de produits industriels, la variante capillaire s'est imposée là où la chromatographie est mal adaptée, notamment sur les petits ions et les acides organiques. Elle s'inscrit dans l'ensemble des méthodes séparatives avancées pour mélanges complexes, où le choix se fait selon la nature de l'analyte plutôt que par habitude de laboratoire.

Attention enfin à un homonyme de procédé. La cataphorèse, employée en traitement de surface, met en jeu le même déplacement de particules chargées sous champ électrique, mais pour déposer un film de peinture sur une pièce métallique. Elle relève du revêtement, pas de la séparation, et le vocabulaire commun prête régulièrement à confusion dans les cahiers des charges. Le procédé est décrit dans cataphorèse.