Hplc : définition et principe

L'HPLC, pour High Performance Liquid Chromatography, est appelée en français chromatographie en phase liquide à haute performance (CLHP). Cette technique de séparation analytique permet d'identifier et de doser les constituants d'un mélange, y compris lorsqu'ils ne sont présents qu'à l'état de traces.

Qu'est-ce que l'HPLC et pourquoi est-elle indispensable en laboratoire ?

L'HPLC fait circuler un échantillon dissous dans un solvant, la phase mobile, à travers une colonne remplie de fines particules, la phase stationnaire. Chaque composé interagit plus ou moins fortement avec cette phase et sort de la colonne à un moment qui lui est propre. Les constituants du mélange sont ainsi séparés, puis mesurés un à un par un détecteur placé en sortie de colonne.

Héritière de la chromatographie décrite par le botaniste Mikhaïl Tswett au début du XXe siècle, la technique s'est imposée à partir des années 1970 avec l'arrivée des pompes haute pression et des phases stationnaires greffées. Elle est aujourd'hui la méthode de référence pour les composés non volatils ou sensibles à la chaleur : médicaments, protéines, vitamines, sucres, pesticides. Les évolutions majeures en chromatographie liquide, de la réduction de la taille des particules aux couplages avec la spectrométrie de masse, expliquent sa place centrale dans les laboratoires de contrôle comme de recherche.

Les principes fondamentaux du fonctionnement de la HPLC

La séparation repose sur un équilibre de partage. À chaque instant, une molécule se répartit entre la phase mobile, qui l'entraîne, et la phase stationnaire, qui la retient. Plus son affinité pour la phase stationnaire est forte, plus elle progresse lentement dans la colonne. Des composés de structures très proches, qui ne diffèrent parfois que par un groupement chimique, finissent ainsi par sortir à des instants distincts.

La phase stationnaire et la phase mobile : le cœur de la séparation

La phase stationnaire est le plus souvent une silice poreuse dont la surface a été greffée de chaînes organiques, par exemple des chaînes octadécyle, notées C18. La phase mobile est un solvant ou un mélange de solvants, typiquement de l'eau associée à de l'acétonitrile ou du méthanol, parfois additionnée d'un tampon pour contrôler le pH. Le chromatographiste règle la rétention en jouant sur la composition de cette phase mobile. En mode isocratique, elle reste constante pendant toute l'analyse. En mode gradient, sa force éluante augmente progressivement pour faire sortir, en fin d'analyse, les composés les plus retenus.

Le rôle de la haute pression dans le processus chromatographique

L'efficacité d'une colonne augmente quand la taille des particules diminue : les échanges entre les deux phases sont plus rapides et les pics plus fins. Mais un lit de particules de 3 à 5 µm oppose une forte résistance à l'écoulement. Pour maintenir un débit de l'ordre du millilitre par minute, la pompe doit délivrer une pression de plusieurs centaines de bars, jusqu'à environ 400 bars pour un système HPLC classique. C'est d'ailleurs cette pression qui a d'abord donné son nom à la technique, longtemps appelée chromatographie liquide haute pression.

De quoi est composé un système HPLC ? Les éléments clés

Une chaîne HPLC comprend des réservoirs de solvants et un dégazeur, une pompe, un injecteur, une colonne placée dans un four thermostaté, un ou plusieurs détecteurs et un logiciel d'acquisition qui enregistre le signal sous forme de chromatogramme.

L'unité de pompage et l'injecteur

La pompe, généralement à pistons alternatifs, délivre un débit stable et le plus exempt possible de pulsations. Les pompes binaires ou quaternaires mélangent plusieurs solvants pour réaliser des gradients. L'injecteur introduit un volume précis d'échantillon, de quelques microlitres à une centaine de microlitres, par l'intermédiaire d'une vanne à boucle qui bascule l'échantillon dans le flux sans interrompre la pression. Les passeurs automatiques enchaînent des dizaines d'injections sans intervention, ce qui garantit la répétabilité des analyses de routine.

La colonne chromatographique : le compartiment de séparation

La colonne est un tube en acier inoxydable, typiquement de 50 à 250 mm de long et de 2 à 4,6 mm de diamètre interne, rempli de phase stationnaire. Sa longueur, sa granulométrie et la chimie de greffage déterminent la résolution obtenue. Une précolonne placée en amont retient les impuretés qui pourraient colmater la colonne analytique et prolonge sa durée de vie. Enfin, la température du four agit sur la viscosité de la phase mobile et sur la reproductibilité des temps de rétention.

Les différents types de détecteurs (UV-Vis, fluorescence, masse)

• Le détecteur UV-visible est le plus répandu. Il mesure l'absorbance des composés qui possèdent un chromophore. Sa version à barrette de diodes enregistre le spectre complet de chaque pic, ce qui aide à l'identification et au contrôle de pureté.
• Le détecteur de fluorescence est nettement plus sensible et plus sélectif. Il est réservé aux molécules naturellement fluorescentes, comme certains hydrocarbures aromatiques polycycliques ou les aflatoxines, ou rendues fluorescentes par une réaction de dérivation.
• Le spectromètre de masse, couplé à la chromatographie (LC-MS), identifie les composés par leur masse et leur fragmentation. C'est la référence pour les analyses de traces et les matrices complexes.
• D'autres détecteurs complètent l'offre : le réfractomètre pour les sucres et les polymères dépourvus de chromophore, le détecteur évaporatif à diffusion de lumière ou le détecteur électrochimique.

Les différentes variantes de la chromatographie liquide

Le mode de séparation se choisit selon la propriété physico-chimique qui distingue le mieux les composés à analyser : leur polarité, leur charge électrique ou leur taille.

HPLC en phase inverse (RP-HPLC) vs phase normale

En phase normale, historiquement la première, la phase stationnaire est polaire (silice nue) et la phase mobile apolaire (hexane, heptane) : les composés polaires sont les plus retenus. En phase inverse, le rapport s'inverse. La phase stationnaire est apolaire (C18, C8) et la phase mobile polaire et aqueuse, si bien que les composés hydrophobes sortent en dernier. La phase inverse concentre aujourd'hui la grande majorité des méthodes, car elle est robuste, reproductible et compatible avec les échantillons aqueux et biologiques. La phase normale reste utile pour séparer des isomères ou des composés peu solubles dans l'eau.

La chromatographie par échange d'ions et d'exclusion stérique

En échange d'ions, la phase stationnaire porte des groupements chargés qui retiennent les ions de charge opposée, et l'élution se pilote par la force ionique ou le pH de la phase mobile. Elle sert au dosage des anions et cations minéraux, des acides aminés ou des protéines. L'exclusion stérique sépare les molécules selon leur taille : les plus petites pénètrent dans les pores de la phase et sont retardées, les plus grosses sortent en premier. Appelée aussi chromatographie de perméation de gel, elle permet de déterminer la distribution des masses molaires d'un polymère.

Domaines d'application de la technique HPLC

Sa polyvalence en fait un outil commun à la pharmacie, à la biologie médicale, à l'agroalimentaire, à l'environnement, à la chimie fine et à l'industrie des polymères.

Analyses pharmaceutiques et biomédicales

Dans l'industrie pharmaceutique, l'HPLC dose le principe actif, recherche les impuretés et les produits de dégradation, et suit la stabilité des formulations dans le temps. De nombreuses monographies de pharmacopée prescrivent une méthode de chromatographie liquide pour le contrôle des substances. En biologie médicale, elle sert au suivi thérapeutique des médicaments, au dosage de vitamines ou à la mesure de l'hémoglobine glyquée (HbA1c) chez les patients diabétiques.

Contrôle qualité dans l'industrie agroalimentaire et environnementale

En agroalimentaire, l'HPLC dose les vitamines, les sucres, les additifs comme les conservateurs, les édulcorants ou les colorants, et recherche les mycotoxines. En biochimie alimentaire, elle s'inscrit dans une panoplie de méthodes où elle côtoie l'analyse isotopique, par exemple pour authentifier des vins et détecter les fraudes. Dans l'environnement, elle permet de rechercher les pesticides et leurs métabolites dans les eaux, les hydrocarbures aromatiques polycycliques ou certains perturbateurs endocriniens. Le couplage HPLC-ICP-MS va plus loin en distinguant les différentes formes chimiques d'un même élément, par exemple l'arsenic minéral, très toxique, de l'arsenic organique présent dans les produits de la mer.

Comment interpréter les résultats d'un chromatogramme ?

Le chromatogramme représente le signal du détecteur en fonction du temps. Chaque pic correspond à un composé, et sa lecture repose sur quatre notions.

• Le temps de rétention, mesuré au sommet du pic, sert à identifier le composé par comparaison avec un étalon injecté dans les mêmes conditions.
• L'aire du pic, ou sa hauteur, est proportionnelle à la quantité de composé. La quantification passe par une droite d'étalonnage, établie avec des solutions de concentration connue, ou par un étalon interne.
• La ligne de base traduit le signal en l'absence de composé. Son bruit fixe les limites de détection et de quantification, conventionnellement atteintes pour un rapport signal sur bruit de 3 et de 10.
• La résolution et la forme des pics indiquent la qualité de la séparation. Une résolution supérieure ou égale à 1,5 correspond à deux pics séparés jusqu'à la ligne de base, et un pic qui traîne signale une interaction parasite ou une colonne usée.

Avantages et limites de la méthode HPLC par rapport à l'UHPLC

L'UHPLC, ou chromatographie liquide ultra haute performance, commercialisée depuis le milieu des années 2000, pousse la logique de l'HPLC plus loin : des particules plus fines, donc des pressions plus élevées, pour des analyses plus rapides et mieux résolues.

L'HPLC conserve de solides avantages : un parc d'instruments très répandu, des colonnes moins coûteuses et surtout des méthodes validées, notamment dans les industries réglementées, où tout changement de système impose une revalidation. L'UHPLC s'impose quand le débit d'échantillons, la finesse de séparation ou le couplage avec la spectrométrie de masse deviennent prioritaires.

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