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Auteur(s)
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Marcel CAUDE : Ingénieur du Conservatoire National des Arts et Métiers (CNAM) - Docteur ès Sciences - Directeur de Recherche au Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS)
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Alain JARDY : Ingénieur CNAM - Docteur ès Sciences - Maître de Conférences à l’École Supérieure de Physique et Chimie de Paris
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Lire l’articleINTRODUCTION
La chromatographie en phase liquide sur colonnes est devenue un outil analytique performant utilisé dans des domaines variés. Ce développement est dû à la fois à une meilleure compréhension des mécanismes d’interaction − au demeurant de plus en plus diversifiés −, aux grandes efficacités obtenues avec des phases stationnaires de plus en plus fines (3 µm) et enfin aux progrès importants effectués dans le domaine de l’appareillage, en particulier pour la détection.
La chromatographie en phase liquide couvre un vaste domaine d’applications que l’on peut scinder en quatre grands thèmes : pétrochimie, environnement, pharmacie et fluides biologiques, produits alimentaires et agroalimentaires (les séparations d’isomères optiques, l’analyse de composés inorganiques et de polymères font l’objet d’autres articles de ce traité).
Nous nous contenterons, devant l’abondance de la littérature, de donner pour chaque thème des références d’ouvrages et articles récents de synthèse et, à titre d’exemple, nous développerons deux applications caractéristiques.
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2. Exemples d’applications
2.1 Analyse des acides aminés dans des matrices complexes
L’importance de la séparation des acides aminés tient au fait qu’ils sont les éléments de base des protéines, constituants fondamentaux des cellules vivantes.
De ce fait, ils sont présents dans les différents milieux biologiques. Aux acides aminés classiques s’ajoutent d’autres acides aminés dont la nature dépend soit du milieu biologique, soit de la méthode d’hydrolyse effectuée dans le cas des protéines. A titre d’exemple, la glutamine et l’asparagine sont transformées en acides correspondants dans les hydrolysats de protéines après l’hydrolyse acide. En revanche, elles sont présentes dans les hydrolysats de protéines ayant subi une hydrolyse enzymatique. On les trouve également dans des échantillons alimentaires (jus de fruits, par exemple). Il est illusoire de vouloir utiliser une méthode différente, adaptée à chaque mélange. Il est, de loin, préférable de disposer d’une méthode unique suffisamment performante pour s’adapter à tous les milieux rencontrés. C’est pourquoi une méthode chromatographique permettant de séparer les 31 acides aminés susceptibles d’être présents dans les fluides physiologiques et les échantillons agroalimentaires a été proposée.
La chromatographie en phase liquide est une méthode de choix pour l’analyse de ces molécules peu volatiles [106]. La séparation et la détection des acides aminés ne peuvent être dissociées car la détection directe par absorptiométrie n’est ni suffisamment sensible ni suffisamment spécifique pour le dosage dans les milieux biologiques.
Deux voies sont possibles : dérivation avant la séparation chromatographique (précolonne) ou après (postcolonne), et deux modes de détection sont principalement utilisés : la spectrophotométrie UV et la spectrofluorimétrie.
La difficulté de la séparation des acides aminés résulte de la variété des molécules concernées qui sont soit purement aliphatiques : glycine, alanine, valine, etc., soit aromatiques : phénylalanine, tyrosine ; elles peuvent, en outre, posséder une fonction alcool : sérine, thréonine ; elles peuvent posséder une deuxième fonction amine : lysine, arginine, etc., ou une deuxième fonction acide : acide aspartique, etc. La fonction amine est souvent primaire, mais elle peut aussi...
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