Spectrophotométrie : définition et explications

Spectrométrie et spectrophotométrie sont des méthodes d’analyse grâce auxquelles on parvient à déterminer le taux d’absorbance d’une substance chimique, c’est-à-dire sa capacité d’absorption de la lumière. Pour procéder à un dosage par spectrophotométrie, on utilise un appareil spécial, le spectrophotomètre qui est capable d’évaluer le spectre d'absorbance d’une solution. Le principe de la spectrophotométrie est simple : l'appareil réalise une mesure de l'intensité de la lumière qu’il reçoit, une fois celle-ci passée à travers un récipient transparent (cuvette dont la matière doit être adaptée à la longueur d’onde), contenant la solution à étudier. À partir de l'intensité de la lumière qui est émise (notée I₀) et d’après la mesure de l'intensité de la lumière transmise (I), l'appareil calcule l'absorbance (A). La formule algébrique de cette opération est : A = log(I₀/I).

On peut complexifier ces données en tenant compte de la loi de Beer-Lambert qui précise que l’absorbance dépend de façon proportionnelle à la concentration d’une solution, dans la mesure où celle-ci est située en deçà de 10^-2 mol.l^-1. De fait, il devient possible, en mesurant l'absorbance, de calculer la concentration d'une solution et même d’observer la cinétique d'une réaction chimique (une réaction enzymatique). La méthode de spectrophotométrie est très fréquemment utilisée en raison de ses nombreux avantages : elle est facile à mettre en œuvre, elle permet d’étudier des molécules biologiques en solution et de déterminer leur concentration, elle ne nécessite que des mesures simples et elle peut également permettre de tester un ensemble de paramètres annexes, tels que la température, le pH, etc. On utilise en général une spectrophotométrie UV, laquelle permet aussi de mesurer l'absorbance de gaz ou de solides bien que cela soit plus rare que des solutions. Toutefois, l'absorption UV-visible n'est pas un test spécifique pour tout composé, car il peut être perturbé par divers éléments, comme la nature du solvant, le pH de la solution, sa température, la présence d’impuretés…