Spectrophotométrie : définition et explications

Ce que mesure réellement un spectrophotomètre

L'instrument ne mesure pas une concentration. Il mesure deux intensités lumineuses et fait un rapport. Un faisceau d'intensité I₀ traverse la cuve de référence, un faisceau d'intensité I traverse l'échantillon, et l'appareil en déduit la transmittance T = I / I₀, puis l'absorbance A = log₁₀(1/T). Tout le reste, concentration, pureté, couleur, est une interprétation de cette grandeur.

L'absorbance a l'avantage d'être additive et, dans son domaine de validité, proportionnelle à la quantité de matière traversée. Une solution qui laisse passer 10 % de la lumière a une absorbance de 1, celle qui en laisse passer 1 % une absorbance de 2. La conséquence pratique est immédiate : au-delà de A = 2, le détecteur travaille sur un signal résiduel de quelques pour mille et la précision s'effondre. C'est la raison pour laquelle un laboratoire dilue ses solutions trop concentrées plutôt que de faire confiance à la lecture.

La loi de Beer-Lambert relie l'absorbance à la concentration : A = ε × l × c, où ε est le coefficient d'absorption molaire de l'espèce chimique à la longueur d'onde de travail, l le trajet optique en centimètres et c la concentration molaire. Deux termes sur trois sont fixés par le montage, ce qui explique la popularité de la méthode : une fois la cuve et la longueur d'onde choisies, l'absorbance ne dépend plus que de la concentration.

Spectrophotomètre, spectromètre, colorimètre : trois instruments, trois usages

Les trois mots circulent comme des synonymes et ne le sont pas. Le point de départ commun est la mesure d'un signal en fonction de la longueur d'onde ; ce qui change, c'est ce que l'appareil en fait.

• Le spectromètre disperse un rayonnement et en restitue le spectre. C'est un terme générique, qui couvre aussi bien la spectrométrie de masse que la spectrométrie d'émission, où aucune absorption de lumière n'est en jeu.
• Le spectrophotomètre mesure spécifiquement le rapport de deux flux lumineux, donc une absorbance ou une réflectance, longueur d'onde par longueur d'onde. C'est l'instrument du dosage et de la mesure de couleur, et son utilisation couvre aussi bien le laboratoire d'analyse que le contrôle de produits finis.
• Le colorimètre travaille sur quelques bandes larges au lieu d'un spectre complet, avec des filtres plutôt qu'un monochromateur. Moins cher, plus rapide, il suffit pour un contrôle de routine mais ne permet pas de choisir librement la bande retenue pour mesurer l'échantillon.

Dans un spectrophotomètre UV-visible, l'architecture est presque toujours la même : une ou deux lampes, un monochromateur à réseau qui sélectionne une bande spectrale étroite, le compartiment échantillon, un détecteur. Les modèles à double faisceau séparent le rayonnement en deux voies et compensent en temps réel la dérive de la source, ce qui devient déterminant sur les mesures longues. Les appareils à barrette de diodes inversent l'ordre : l'échantillon reçoit toute la lumière et la dispersion se fait après, ce qui donne le spectre complet en une fraction de seconde. Le principe et ses variantes sont détaillés dans spectrophotométrie d'absorption dans l'ultraviolet et le visible.

Le choix des optiques mérite autant d'attention que celui de l'électronique. Le verre optique coupe l'ultraviolet vers 320 nm : une cuve en verre utilisée à 280 nm ne mesure rien d'exploitable. Sous cette limite, le quartz est le seul matériau courant. Les cuves en plastique jetables, pratiques pour les tests de routine dans le visible, se déforment et diffusent dès que le solvant les attaque.

Étalonnage et sources d'erreur

Un spectrophotomètre est un comparateur, pas un compteur. Il ne délivre un résultat juste qu'après un étalonnage en deux temps.

Le premier est le blanc, ou zéro d'absorbance. On remplit la cuve du solvant et de tous les réactifs sauf l'analyte, puis on impose A = 0. Ce geste soustrait l'absorption du solvant, celle des parois et les réflexions aux interfaces. Un blanc négligé décale toutes les mesures de la série dans le même sens, une erreur d'autant plus dangereuse qu'elle ne se voit pas sur la répétabilité.

Le second est la droite d'étalonnage. On mesure une gamme de solutions de concentration connue, on trace A en fonction de c et on vérifie la linéarité avant d'y projeter les échantillons inconnus. La proportionnalité n'est jamais acquise sur toute la plage : aux fortes concentrations, les interactions entre molécules et la diffusion la font décrocher, toujours vers le bas. Les autres sources d'erreur sont connues et se traitent par méthode plutôt que par instrument. La lumière parasite, fraction de rayonnement qui atteint le détecteur sans traverser l'échantillon, plafonne l'absorbance maximale mesurable. Les bulles et les particules en suspension diffusent le faisceau et se traduisent par une absorbance apparente qui ne correspond à aucune absorption. La température modifie ε pour beaucoup de composés, ce qui impose un porte-cuve thermostaté sur les mesures fines. Enfin, une cuve mal orientée ou rayée sur la face optique suffit à ruiner une série entière de résultats.

Du dosage chimique à la mesure de couleur

Deux familles d'usages coexistent sous le même nom, avec des instruments dont le réglage n'a presque rien en commun.

La première est l'analyse quantitative en solution. Dosage des protéines par formation d'un complexe coloré, contrôle de la teneur en fer ou en phosphates d'une eau, suivi d'une cinétique enzymatique, mesure de pureté d'un acide nucléique par le rapport des absorbances à 260 et 280 nm : la méthode s'est imposée parce qu'elle est rapide, peu destructive et transposable à des automates de laboratoire. Les applications en chimie pharmaceutique sont développées dans analyse fonctionnelle par colorimétrie et fluorimétrie, et les usages sur polymères dans caractérisation des polymères par spectrométrie optique.

La seconde est la mesure de couleur sur des surfaces opaques, par réflectance. L'appareil éclaire la surface, mesure le spectre réfléchi, puis calcule des coordonnées colorimétriques dans un espace normalisé, le plus courant étant le CIE L*a*b*. L'écart entre deux échantillons s'exprime alors par une distance dans cet espace, ce qui remplace l'appréciation visuelle par un nombre opposable au fournisseur. Les industries de la peinture, du textile, de l'automobile, de l'impression et du plastique en ont fait un outil de contrôle de conformité, avec des modèles portables utilisés directement en ligne de production. Le cadre théorique est traité dans colorimétrie.

Il faut aussi savoir quand la spectrophotométrie n'est pas la bonne réponse. Elle exige que l'espèce recherchée absorbe dans le domaine accessible, ce qui n'est pas le cas de la plupart des ions métalliques sans réactif complexant. Elle dose mal les mélanges dont les spectres se recouvrent. Et elle plafonne en sensibilité bien avant les méthodes atomiques : pour des traces au microgramme par litre, on passe à la spectrométrie d'absorption atomique, et pour identifier une structure moléculaire plutôt que la doser, à la spectrométrie Raman.

Comment choisir un spectrophotomètre

Le premier critère n'est pas la marque mais le domaine utile. Un spectrophotomètre visible seul, moins cher, couvre l'essentiel des dosages colorimétriques de contrôle. Un spectrophotomètre UV-visible devient indispensable dès qu'il faut lire des protéines, des acides nucléiques ou des composés aromatiques, qui absorbent tous sous 300 nm. Ces deux différents niveaux de gamme ne se départagent pas au prix mais à l'usage.

Viennent ensuite quatre paramètres que les fiches techniques présentent rarement au même endroit. La résolution spectrale, qui conditionne la capacité à séparer deux bandes voisines : peu important sur un dosage de routine, déterminant sur un spectre structuré ou sur une mesure à haute exigence. La lumière parasite, qui fixe l'absorbance maximale exploitable. La stabilité de la ligne de base, décisive sur les cinétiques longues. Le format enfin : un appareil de paillasse à double faisceau et un appareil portable à barrette de diodes ne servent pas les mêmes usages, et le second se justifie par la mesure sur site plus que par ses performances.

Le consommable pèse enfin davantage qu'on ne l'imagine : cuves en quartz appairées, lampe au deutérium à durée de vie limitée, cuves jetables. Sur un poste de contrôle qui tourne, ces postes dépassent souvent l'amortissement de l'équipement.