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Présentation
Auteur(s)
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Bertrand MONÉGIER : Rhône Poulenc Rorer - Centre de recherche de Vitry-Alfortville - Responsable du laboratoire de spectrométrie de masse
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Lire l’articleINTRODUCTION
La détermination des masses moléculaires supérieures à 2 000 ou 3 000 daltons (Da) exige l’utilisation d’aimants à haut champ ou de spectromètres équipés d’analyseurs à temps de vol. Le premier type d’appareillage, fort coûteux, fait appel à l’ionisation par LSIMS (Liquid Secondary lon Mass Spectrometry) et reste limité à des masses inférieures à 10 000 Da ; dans le deuxième cas, l’ionisation par les produits de fission du 252Cf (PDMS - Plasma Desorption Mass Spectrometry) ne permet guère d’aller au-delà de 25 à 30 kDa, avec une précision souvent insuffisante pour vérifier sans ambiguïté la conformité des produits analysés.
Deux techniques récentes, le MALDI-TOF (Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation - Time Of Flight) et l’électrospray, ont constitué une véritable révolution pour l’analyse des composés de haute masse moléculaire, tout particulièrement les peptides et les biomolécules (protéines, fragments d’ADN et d’ARN).
L’originalité de l’électrospray réside dans sa capacité à obtenir des molécules portant plusieurs dizaines de charges. La spectrométrie de masse mesure toujours le rapport de la masse d’un ion, divisé par le nombre de charges qu’il porte (m/z). Par conséquent, une protéine de 50 000 Da portant 50 charges dues à des protons est détectée à une masse apparente de 1 001 [(50 000 + 50)/50]. Autrement dit, la zone d’observation des différentes espèces ioniques est ramenée dans une gamme de rapports m/z tout à fait compatible avec l’utilisation d’analyseurs quadrupolaires.
Une autre caractéristique de l’électrospray vient du fait que le processus d’ionisation se produit en phase liquide et à la pression atmosphérique. Il est d’autre part tout à fait adapté à l’étude des composés polaires ou thermosensibles (l’ionisation se produit en effet à température ambiante). Son couplage avec les techniques chromatographiques en phase liquide était donc logique, supplantant même, tant sa réalisation est aisée, les techniques du thermospray et de l’interface à courroie mobile, délicates à mettre en œuvre et dont les applications restent, en comparaison, par trop ponctuelles.
Le nombre de publications dans ce domaine est devenu considérable, que ce soit pour l’analyse de métabolites, la caractérisation d’impuretés diverses, l’identification précoce de produits d’origine naturelle, ou encore pour l’étude de milieux biologiques complexes.
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Présentation
Interprétation des spectres1. Principe
1.1 Description de l’interface
Ce mode d’ionisation s’effectue à la pression atmosphérique et à température ambiante. L’échantillon en solution est introduit (au moyen d’un pousse-seringue ou d’une pompe chromatographique) dans l’appareil par l’intermédiaire d’un capillaire dont l’extrémité traverse une aiguille métallique portée à un potentiel de plusieurs kilovolts (typiquement 3 à 5 kV). Il en résulte la formation de gouttelettes mono- ou polychargées, qui conduisent, par désolvatation, à des ions en phase gazeuse (figure 1).
On utilise parfois le terme IonSpray quand la nébulisation est assistée pneumatiquement par un courant d’azote coaxial au débit, qui permet essentiellement de pouvoir utiliser une gamme de débits nettement plus importante (5 à 200 ou 300 µL/min), voire parfois même jusqu’à 1 mL/min, contre quelques µL/min seulement sans gaz nébulisateur). Dans la suite de cet article, nous nommerons indifféremment ces deux techniques électrospray, le principe d’ionisation étant rigoureusement identique dans les deux cas.
À quelques millimètres de l’aiguille est placée une contre-électrode qui permet de diriger le faisceau ionique vers l’interface, constituée généralement d’un orifice conique dont le diamètre est de l’ordre d’une centaine de micromètres. Un flux d’azote, dirigé le plus souvent à contre-courant du trajet des ions, joue un rôle prépondérant dans le processus de désolvatation puisqu’il permet de sécher les solvants résiduels de façon que seuls les ions en phase gazeuse puissent traverser l’orifice pour pénétrer dans l’enceinte de l’appareil.
Il existe un certain nombre de variantes, selon les constructeurs. Certains utilisent un capillaire de transfert chauffé entre l’orifice et l’analyseur, de façon à optimiser la désolvatation. D’autres proposent, pour des débits supérieurs à quelques dizaines de microlitres par minute, d’ajouter un courant d’azote chaud, traversant le nébulisat extérieur et dirigé vers l’orifice, afin d’améliorer à la fois la sensibilité et le rapport signal sur bruit.
Le vide dans l’analyseur doit être maintenu en permanence entre 10–3 et 10–4 Pa. Afin de maintenir cette pression,...
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Principe
BIBLIOGRAPHIE
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(1) - DOLE (M.), MACH (L.L.), HINES (R.L.), MOBLEY (R.C.), FERGUSSON (L.D.), ALICE (M.B.) - Molecular beams of macroions. - J. Chem. Phys. 1968, 49, p. 2240-2249.
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(2) - MANN (M.) - Electrospray : its potential and limitations as an ionization method for biomolecules. - Org. Mass Spectrom. 1990, 25, p. 575-587.
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(3) - ROELLGEN (F.W.), BRAMER-WEGER (E.), BUETFERING (L.) - Field ion emission from liquid solutions : Ion evaporation against electrohydrodynamic disintegration. - J. Phys. Col. (Paris). 1987, C6, 48, p. 253-256.
-
(4) - THOMSON (S.A.), IRBANE (J.V.) - Field induced ion evaporation from liquid surfaces at atmospheric pressure. - J. Chem. Phys. 1979, 71, p. 4451-4463.
-
(5) - WONG (S.F.), MENG (C.K.), FENN (J.B.) - Multiple charging in electrospray ionization of polyethylene glycols. - J. Phys. Chem. 1988, 92, p. 546.
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(6) - FENN (J.B.), MANN...
ANNEXES
Tous les constructeurs développent maintenant ce type d’interface. Les progrès réalisés en ce qui concerne l’instrumentation scientifique ont en même temps considérablement réduit le prix des appareils avec des performances encore accrues.
Comme constructeurs, on peut citer :
Waters Corporation/Micromass http://www.waters.com
MDS Sciex http://www.mdssciex.com
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