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Auteur(s)
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Bertrand MONÉGIER : Rhône Poulenc Rorer - Centre de recherche de Vitry-Alfortville - Responsable du laboratoire de spectrométrie de masse
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Lire l’articleINTRODUCTION
La détermination des masses moléculaires supérieures à 2 000 ou 3 000 daltons (Da) exige l’utilisation d’aimants à haut champ ou de spectromètres équipés d’analyseurs à temps de vol. Le premier type d’appareillage, fort coûteux, fait appel à l’ionisation par LSIMS (Liquid Secondary lon Mass Spectrometry) et reste limité à des masses inférieures à 10 000 Da ; dans le deuxième cas, l’ionisation par les produits de fission du 252Cf (PDMS - Plasma Desorption Mass Spectrometry) ne permet guère d’aller au-delà de 25 à 30 kDa, avec une précision souvent insuffisante pour vérifier sans ambiguïté la conformité des produits analysés.
Deux techniques récentes, le MALDI-TOF (Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation - Time Of Flight) et l’électrospray, ont constitué une véritable révolution pour l’analyse des composés de haute masse moléculaire, tout particulièrement les peptides et les biomolécules (protéines, fragments d’ADN et d’ARN).
L’originalité de l’électrospray réside dans sa capacité à obtenir des molécules portant plusieurs dizaines de charges. La spectrométrie de masse mesure toujours le rapport de la masse d’un ion, divisé par le nombre de charges qu’il porte (m/z). Par conséquent, une protéine de 50 000 Da portant 50 charges dues à des protons est détectée à une masse apparente de 1 001 [(50 000 + 50)/50]. Autrement dit, la zone d’observation des différentes espèces ioniques est ramenée dans une gamme de rapports m/z tout à fait compatible avec l’utilisation d’analyseurs quadrupolaires.
Une autre caractéristique de l’électrospray vient du fait que le processus d’ionisation se produit en phase liquide et à la pression atmosphérique. Il est d’autre part tout à fait adapté à l’étude des composés polaires ou thermosensibles (l’ionisation se produit en effet à température ambiante). Son couplage avec les techniques chromatographiques en phase liquide était donc logique, supplantant même, tant sa réalisation est aisée, les techniques du thermospray et de l’interface à courroie mobile, délicates à mettre en œuvre et dont les applications restent, en comparaison, par trop ponctuelles.
Le nombre de publications dans ce domaine est devenu considérable, que ce soit pour l’analyse de métabolites, la caractérisation d’impuretés diverses, l’identification précoce de produits d’origine naturelle, ou encore pour l’étude de milieux biologiques complexes.
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Conclusion3. Applications
3.1 Étude des biomolécules
Historiquement, l’électrospray doit sans doute ses premiers succès à la possibilité de mesurer la masse moléculaire de peptides et de protéines intactes jusqu’à environ 100 000 Da [11]. Auparavant, caractériser de tels composés nécessitait de procéder au préalable à une hydrolyse enzymatique, de séparer et d’isoler les différents peptides de coupure, et enfin de combiner microséquençage et détermination de leur masse moléculaire par LSIMS.
La précision des mesures, liée à la sensibilité de la technique, en fait maintenant un outil incontournable pour l’étude de conformité des peptides et des protéines [12], de même, en ions négatifs, pour les oligonucléotides. Dans le cas des protéines, endogènes ou recombinantes, les biochimistes sont souvent confrontés à des problèmes de conformité et de modification post-traductionnelles qui ne sont pas toujours détectables par dégradation d’Edman (séquençage d’acides aminés) ou par analyse d’acides aminés. Quand les séquences d’acides aminés sont connues, la seule détermination de la masse moléculaire, combinée aux techniques plus classiques de chimie des protéines, permet notamment, parfois même au sein de mélanges :
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d’identifier l’extrémité C-terminale de polypeptides dont l’extrémité N-terminale a été déterminée par séquençage ;
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de montrer des inhomogénéités C- et N-terminales [13] ;
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de caractériser certaines modifications post-traductionnelles [14] : l’écart entre la masse expérimentale et la masse calculée d’après sa séquence permet d’identifier ou de réduire le nombre d’hypothèses sur la nature chimique des modifications (phosphorylations, glycosylations, liaisons avec des lipides ou des acides nucléiques) ;
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de confirmer la bonne maturation des ponts disulfures ou de caractériser la formation de dimères covalents. Signalons à ce propos que si le nombre maximal de charges observées pour des peptides ne contenant pas de pont disulfure est en général proche du nombre de résidus basiques (arginine, lysine, histidine, NH2 terminal), la présence de ponts disulfures dans la molécule...
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BIBLIOGRAPHIE
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(1) - DOLE (M.), MACH (L.L.), HINES (R.L.), MOBLEY (R.C.), FERGUSSON (L.D.), ALICE (M.B.) - Molecular beams of macroions. - J. Chem. Phys. 1968, 49, p. 2240-2249.
-
(2) - MANN (M.) - Electrospray : its potential and limitations as an ionization method for biomolecules. - Org. Mass Spectrom. 1990, 25, p. 575-587.
-
(3) - ROELLGEN (F.W.), BRAMER-WEGER (E.), BUETFERING (L.) - Field ion emission from liquid solutions : Ion evaporation against electrohydrodynamic disintegration. - J. Phys. Col. (Paris). 1987, C6, 48, p. 253-256.
-
(4) - THOMSON (S.A.), IRBANE (J.V.) - Field induced ion evaporation from liquid surfaces at atmospheric pressure. - J. Chem. Phys. 1979, 71, p. 4451-4463.
-
(5) - WONG (S.F.), MENG (C.K.), FENN (J.B.) - Multiple charging in electrospray ionization of polyethylene glycols. - J. Phys. Chem. 1988, 92, p. 546.
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(6) - FENN (J.B.), MANN...
ANNEXES
Tous les constructeurs développent maintenant ce type d’interface. Les progrès réalisés en ce qui concerne l’instrumentation scientifique ont en même temps considérablement réduit le prix des appareils avec des performances encore accrues.
Comme constructeurs, on peut citer :
Waters Corporation/Micromass http://www.waters.com
MDS Sciex http://www.mdssciex.com
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