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Article

1 - PRÉSENTATION GÉNÉRALE

2 - PURIFICATION DE LA MACROMOLÉCULE

3 - CRISTALLISATION

4 - ENREGISTREMENT DES DONNÉES DE DIFFRACTION

5 - MÉTHODE DE LA SÉRIE ISOMORPHE

  • 5.1 - Détermination des phases. Cas idéal
  • 5.2 - Détermination des phases. Cas réel
  • 5.3 - Obtention des dérivés lourds
  • 5.4 - Détermination de la position des atomes lourds

6 - UTILISATION DE LA DIFFUSION ANOMALE

7 - REMPLACEMENT MOLÉCULAIRE

8 - CARTES DE DENSITÉ ÉLECTRONIQUE

9 - AFFINEMENT D’UNE STRUCTURE CRISTALLOGRAPHIQUE

  • 9.1 - Méthodes de moindres carrés
  • 9.2 - Méthodes de la dynamique moléculaire
  • 9.3 - Maximum de vraisemblance
  • 9.4 - Cartes de densité électronique
  • 9.5 - Particularités des macromolécules biologiques

10 - BASE DE DONNÉES PDB

11 - PERSPECTIVES

| Réf : P1090 v1

Purification de la macromolécule
Cristallographie des macromolécules biologiques

Auteur(s) : Jean CAVARELLI

Date de publication : 10 mars 2000

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Auteur(s)

  • Jean CAVARELLI : Professeur de Biologie structurale, université Louis-Pasteur, Strasbourg

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INTRODUCTION

Les molécules biologiques responsables de toute vie cellulaire sont des hétéropolymères de très grande taille appartenant à deux familles : les protéines et les acides nucléiques. Les processus biologiques compliqués sont les résultats d’interactions dynamiques soit de macromolécules biologiques entre elles, soit de macromolécules avec de petits substrats cellulaires. La compréhension de ces mécanismes nécessite en premier lieu la connaissance des structures tridimensionnelles de ces macromolécules soit seules, soit engagées dans des complexes spécifiques. La connaissance de ces structures est l’un des piliers actuels de la biologie moléculaire et représente une source de progrès qui génère des retombées non seulement en recherche fondamentale mais aussi en recherche appliquée (médicale, agroalimentaire). Cela justifie les investissements importants réalisés depuis plusieurs années dans les secteurs publics et privés. La diffraction des rayons X par des monocristaux est la méthode par excellence pour l’étude des macromolécules biologiques. La cristallographie a permis la détermination des structures tridimensionnelles de plusieurs milliers de macromolécules biologiques dans des gammes de taille et de complexité très variées : petites protéines, oligonucléotides, acides ribonucléiques de transfert, immunoglobulines complexes multienzymatiques, complexes nucléoproté-iques, virus d’insectes, de plantes ou de mammifères. Les propriétés physico-chimiques intrinsèques des macromolécules biologiques donnent naissance à des cristaux avec de grands paramètres de maille cristalline et un pouvoir de diffraction en général limité en comparaison du standard actuel des petites molécules organiques. Cela impose des méthodes et des techniques adaptées tout au long du processus cristallographique. Cette méthodologie propre aux macromolécules biologiques va être présentée dans cet article. L’explosion actuelle de cette méthode est due aux progrès réalisés tant au niveau de la technologie (biologie moléculaire, sources de rayons X, détecteurs de rayons X, supercalculateurs puissants) qu’au niveau des logiciels de traitement des données de diffraction (collecte, phasage, affinement). Cela se traduit par un raccourcissement extraordinaire du délai séparant l’obtention d’un premier cristal et la détermination de la structure cristalline. Une étude cristallographique peut maintenant être conduite en quelques mois après l’obtention des premiers cristaux.

La lecture de cet article suppose une bonne connaissance de la cristallographie géométrique et une première initiation à la théorie de la diffraction des rayons X par des monocristaux. Le lecteur pourra se référer aux articles de A. Authier « Cristallographie géométrique » dans le traité de Sciences Fondamentales [1] et de Y. Jeannin « Résolution d’une structure cristalline par rayons X » dans ce traité Analyse et Caractérisation [3].

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DOI (Digital Object Identifier)

https://doi.org/10.51257/a-v1-p1090


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2. Purification de la macromolécule

L’obtention de cristaux nécessite de disposer de plusieurs milligrammes d’une macromolécule à l’état soluble et avec une très grande pureté. Les premières structures tridimensionnelles de macromolécules correspondaient à des molécules qui pouvaient facilement être obtenues en grande quantité et qui cristallisaient relativement facilement. Aujourd’hui, on aborde une étude cristallographique d’une macromolécule pour résoudre un problème biologique donné. La macromolécule cible peut être disponible en faible quantité, voire être pratiquement insoluble. Néanmoins, la croissance importante du nombre de structures tridimensionnelles résolues vient de l’utilisation des techniques de la biologie moléculaire. Dès que le gène correspondant à la protéine étudiée a pu être identifié, il peut être cloné dans un vecteur d’expression et exprimé dans une cellule hôte procaryotique ou eucaryotique. Les systèmes de surexpression les plus utilisés pour les études structurales sont la bactéries Escherichia coli, les cellules d’insectes associées à un vecteur baculovirus, des cellules de mammifères et la levure. Le système bactérien est le plus facile d’utilisation et permet dans de nombreux cas un niveau élevé de surexpression. Néanmoins, ce système présente deux inconvénients majeurs :

  • de nombreuses protéines eucaryotiques ne se replient pas correctement et précipitent sous forme d’amas insolubles de protéines appelés corps d’inclusion ;

  • de nombreuses modifications post-traductionnelles spécifiques aux systèmes d’origine eucaryotique ne sont pas effectuées.

Dans de nombreux vecteurs d’expression, la protéine est fusionnée soit avec une autre protéine particulière soit avec une queue peptidique, ce qui permet une première étape de purification par colonne d’affinité. Par exemple, l’addition d’une queue polyhistidine permet une première purification de la protéine sur une colonne d’affinité en présence d’ions nickel que chélate la séquence polyhistidine. Un site de clivage à une protéase donnée permet ensuite l’obtention de la protéine seule.

Les techniques de génie génétique permettent aussi d’apporter des modifications ponctuelles de la séquence de la protéine pouvant modifier à bon...

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