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1 - ÉVOLUTIONS VERS LA MICROSCOPIE OPTIQUE À BALAYAGE

  • 1.1 - Télévision associée à la microscopie
  • 1.2 - Microscopie quantitative

2 - MICROSCOPIE CONFOCALE À BALAYAGE LASER

3 - MICROSCOPIE OPTIQUE EN CHAMP PROCHE

Article de référence | Réf : R6714 v1

Microscopie confocale à balayage laser
Microscopies optiques à balayage

Auteur(s) : Gérard ROBLIN

Date de publication : 10 sept. 1999

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RÉSUMÉ

La microscopie optique à balayage est une technique qui évolue sans cesse, en fonction des progrès réalisés dans le domaine de la saisie des informations avec des moyens télévisuels de plus en plus élaborés,  mais également  vers une microscopie dite quantitative avec  l’obtention de données numériques. Cette évolution impose une technique de balayage, pour saisir le champ point par point, tout à fait assimilable à celle de la télévision à balayage électronique. Cet article dresse le bilan actuel  de la  microscopie optique à balayage.

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Auteur(s)

  • Gérard ROBLIN : Docteur ès sciences - Directeur de recherche au Centre national de la recherche scientifique (CNRS) (ER)

INTRODUCTION

L‘observation à travers le microscope, a été longtemps effectuée uniquement à l’aide de l’œil humain. La photographie, dès son apparition, lui a été rapidement appliquée permettant de conserver un document en mémoire, ainsi que la cinématographie donnant accès à l’étude de phénomènes temporellement variables. D’autres informations ont également pu être acquises grâce à l’étude spectroscopique ou spectrophotométrique des objets qui, associée aux tech-niques photographiques, permet notamment l’obtention d’images dans une « couleur » donnée, ce qui est un moyen d’analyse des propriétés d’une préparation ou de reconnaissance de certains de ses éléments.

Il faut donc noter que la microscopie est une technique que les utilisateurs sont toujours prêts à faire évoluer en fonction des progrès réalisés dans le domaine de la saisie des informations. C’est ainsi qu’ils ont profité des possibilités apportées par les moyens télévisuels, leur permettant à la fois une observation collective (plusieurs expérimentateurs pouvant simultanément observer un même champ) et une acquisition d’informations variables en temps réel (à la fréquence de prise de vue près). Mais les besoins du microscopiste sont aussi d’obtenir des informations numériques : comptage d’éléments particuliers préalablement reconnus, tri de constituants de forme caractéristique ou de niveau donné, ainsi que leurs mesures spatiales de surface, de périmètre, de longueur ou de distance... Cette microscopie, dite quantitative, impose de repérer les points du champ par leurs coordonnées spatiales et de leur affecter à chacun un nombre représentatif de leur niveau photométrique. Il y a donc lieu de saisir le champ point par point par une technique de balayage, ce qui est le cas de la télévision résultant d’un balayage électronique, d’en acquérir le niveau individuel par le moyen d’un récepteur photoélectrique, qui peut être le photorécepteur employé en télévision, et de saisir, par des moyens informatiques, l’ensemble de ces données pouvant ainsi être traitées pour fournir l’information souhaitée. Ce besoin de balayage a donné lieu à l’émergence de techniques optiques permettant de l’effectuer en conservant toute la résolution qu’elles permettent, voire en l’améliorant notablement.

Après une présentation sommaire du procédé télévisuel et de la microscopie quantitative, cet article fait le point sur les microscopies optiques à balayage actuelles.

Pour de plus amples renseignements sur la microscopie optique, le lecteur pourra se reporter à l’article R 6 712 de cette rubrique.

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DOI (Digital Object Identifier)

https://doi.org/10.51257/a-v1-r6714


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2. Microscopie confocale à balayage laser

2.1 Présentation de la méthode

Contrairement à la microscopie traditionnelle où le champ est uniformément éclairé, en microscopie optique à balayage celui-ci est balayé de manière continue par l’image d’un point lumineux fournie par l’objectif lui-même, donc par un « spot » dont la dimension est du même ordre que la limite de résolution. Le flux lumineux transmis ou réfléchi en chaque point de l’objet, donc à un instant donné, est recueilli par un photorécepteur unique fournissant un signal portant information sur le niveau photométrique au point considéré, alors qu’en microscopie traditionnelle correspond à chaque point du champ un élément photosensible du récepteur (rétine de l’œil, émulsion photographique, tube de télévision, mosaïque CCD), chacun d’eux pouvant être de sensibilité différente à une même excitation, voire de dimensions différentes, donc fournissant une résolution différente, si le récepteur est constitué d’éléments discrets.

La microscopie flying-spot est à l’origine de cette procédure. L’image du spot d’un tube à rayons cathodiques, ou tube analyseur, balayé dans deux directions est projetée dans le champ par le microscope complet (figure 1). L’information sur le facteur de transmission en chaque point de l’objet est véhiculée par le signal photoélectrique fourni par un photorécepteur placé dans la pupille du condenseur. Une image peut alors être affichée en utilisant ce signal pour moduler l’intensité du faisceau d’électrons (Z) d’un tube moniteur à mémoire à entretien d’image dont le balayage est synchrone de celui du tube analyseur. Il est encore possible d’ajouter ce signal, et à l’origine ce fut probablement l’usage le plus fréquent en microscopie flying-spot, au signal de balayage image (Y) du moniteur fonctionnant ainsi en tube oscilloscope et d’afficher, pour chaque ligne, une courbe représentative de ses variations photométriques. Les deux types d’information, par application du signal photoélectrique tant en Z qu’en Y, peuvent également être affichées simultanément. Avec ce mode d’éclairage, mis à part l’énergie résiduelle dans les pieds de la tache de diffraction, rien ne vient éclairer les autres points du champ...

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BIBLIOGRAPHIE

  • (1) - DE HOFF (R.T.), RHINES (F.N.) -   Microscopie quantitative  -  . Masson (1972).

  • (2) - ROBERTS (F.), YOUNG (J.Z.) -   A flying spot microscope  -  . Nature, 167, 231 (1951).

  • (3) - BOX (H.C.), FREUND (H.) -   Flying-microscope adapted for quantitative measurements  -  . Rev. Sci. Inst., 30, 28-30 (1959).

  • (4) - PLUTA (M.) -   Advanced Light Microscopy  -  . Vol. 1 Principles and basic properties. Vol. 2 Specialized methods. Vol. 3 Measuring techniques. PWN-Polish Scientific Publishers & Elsevier (1989).

  • (5) - WILSON (T.), SHEPPARD (C.) -   Theory and practice of scanning optical microscopy  -  . Academic (1984).

  • (6) - SHEPPARD (C.), CHOUDHURY (A.) -   Image formation in the scanning microscope  -  . Optica Acta, 24, no 10, 1051-1073 (1977).

  • ...

1 Constructeurs

(liste non exhaustive)

Carl Zeiss http://www.zeiss.fr

Leica Microsystems http://www.leica-microsystems.com

Thermo Electron Corp. http://www.thermo.com

Danish Micro Engineering (DME) http://www.dme-spm.dk

Nanonics Imaging Ltd http://www.nanonics.co.il

Optoprim http://www.optoprim.com

Oxford Instruments http://www.oxinst.com

RHK Technology http://www.rhk-tech.com

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