Purification des macromolécules biologiques
Détermination des structures 3D des macromolécules biologiques par diffraction X. Partie 1

L'obtention de cristaux de qualité nécessite de disposer le plus souvent de plusieurs milligrammes de la macromolécule d'intérêt à l'état soluble et avec une très grande pureté. Les premières structures tridimensionnelles de macromolécules correspondaient à des molécules qui pouvaient facilement être obtenues en grande quantité et qui cristallisaient relativement facilement. Aujourd'hui, on aborde une étude cristallographique d'une macromolécule pour résoudre un problème biologique donné. La macromolécule cible peut être disponible en faible quantité, voire pratiquement insoluble. Néanmoins, la croissance importante du nombre de structures tridimensionnelles résolues vient de l'utilisation des techniques de la biologie moléculaire. Dès que le gène correspondant à la protéine étudiée a pu être identifié, il peut être cloné dans un vecteur d'expression et exprimé dans une cellule hôte procaryotique ou eucaryotique.

Les systèmes de surexpression les plus utilisés pour les études structurales sont la bactérie Escherichia coli, les cellules d'insectes associées à un vecteur baculovirus, des cellules de mammifères et la levure. Le système bactérien est le plus facile d'utilisation et permet dans de nombreux cas un niveau élevé de surexpression. Néanmoins, ce système présente deux inconvénients majeurs :

• de nombreuses protéines eucaryotiques ne se replient pas correctement et précipitent sous forme d'amas insoluble de protéines appellés corps d'inclusion ;

• de nombreuses modifications post-traductionnelles spécifiques aux systèmes d'origine eucaryotique ne sont pas effectuées.

Dans de nombreux vecteurs d'expression, la protéine est fusionnée, soit avec une autre protéine particulière, soit avec une queue peptidique, ce qui permet une première étape de purification par colonne d'affinité. Par exemple, l'addition d'une queue polyhistidine permet une première purification de la protéine sur une colonne d'affinité en présence d'ions nickel que chélate la séquence polyhistidine. Un site de clivage à une protéase donnée permet ensuite l'obtention de la protéine seule.

Les techniques de génie génétique permettent aussi d'apporter des modifications ponctuelles de la séquence de la protéine pouvant modifier à bon escient son comportement physico-chimique....