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BiosolvantsARCHIVE | Réf : P1110 v1
Auteur(s) : Jean Cavarelli
Date de publication : 10 sept. 2009
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L'obtention de cristaux de qualité nécessite de disposer le plus souvent de plusieurs milligrammes de la macromolécule d'intérêt à l'état soluble et avec une très grande pureté. Les premières structures tridimensionnelles de macromolécules correspondaient à des molécules qui pouvaient facilement être obtenues en grande quantité et qui cristallisaient relativement facilement. Aujourd'hui, on aborde une étude cristallographique d'une macromolécule pour résoudre un problème biologique donné. La macromolécule cible peut être disponible en faible quantité, voire pratiquement insoluble. Néanmoins, la croissance importante du nombre de structures tridimensionnelles résolues vient de l'utilisation des techniques de la biologie moléculaire. Dès que le gène correspondant à la protéine étudiée a pu être identifié, il peut être cloné dans un vecteur d'expression et exprimé dans une cellule hôte procaryotique ou eucaryotique.
Les systèmes de surexpression les plus utilisés pour les études structurales sont la bactérie Escherichia coli, les cellules d'insectes associées à un vecteur baculovirus, des cellules de mammifères et la levure. Le système bactérien est le plus facile d'utilisation et permet dans de nombreux cas un niveau élevé de surexpression. Néanmoins, ce système présente deux inconvénients majeurs :
de nombreuses protéines eucaryotiques ne se replient pas correctement et précipitent sous forme d'amas insoluble de protéines appellés corps d'inclusion ;
de nombreuses modifications post-traductionnelles spécifiques aux systèmes d'origine eucaryotique ne sont pas effectuées.
Dans de nombreux vecteurs d'expression, la protéine est fusionnée, soit avec une autre protéine particulière, soit avec une queue peptidique, ce qui permet une première étape de purification par colonne d'affinité. Par exemple, l'addition d'une queue polyhistidine permet une première purification de la protéine sur une colonne d'affinité en présence d'ions nickel que chélate la séquence polyhistidine. Un site de clivage à une protéase donnée permet ensuite l'obtention de la protéine seule.
Les techniques de génie génétique permettent aussi d'apporter des modifications ponctuelles de la séquence de la protéine pouvant modifier à bon escient son comportement physico-chimique....
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(1) - AUTHIER (A.) - Cristallographie géométrique. - [A 1 305] Physique Chimie (1993).
(2) - JEANNIN (Y.) - Résolution d'une structure cristalline par rayons X. - [P 1 075] Techniques d'analyse (1998).
(3) - JEANNIN (Y.) - Détermination de structure cristalline par rayons X : méthodes numériques. - [P 1 076] Techniques d'analyse (1996).
(4) - BROLL (N.) - Caractérisation de solides cristallisés par diffraction X. - [P 1 080] Techniques d'analyse (1996).
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Les articles ci-dessous développent, illustrent et complètent, certains aspects présentés dans cette revue :
LASKOWSKI (R.A.) - THORNTON (J.M.) - Understanding the molecular machinery of genetics through 3D structures. - Nat. Rev. Genet., 9(2), p. 141-151, fév. 2008.
ALBER (F.) - ORSTER (F.) - KORKIN (D.) - TOPF (M.) - SALI (A.) - Integrating Diverse Data for Structure Determination of Macromolecular Assemblies. - Annu. Rev. Biochem., 77, p. 443-477 (2008).
CHRUSZCZ (M.) - WLODAWER (A.) - MINOR (W.) - Determination of Protein Structures. A Series of Fortunate Events. - Biophysical Journal, vol. 95, p. 1-9, juil. 2008.
WLODAWER (A.) - MINOR (W.) - DAUTER (Z.) - JASKOLSKI (M.) - Protein crystallography for non-crystallographers. - FEBS Journal, 275 (1), p. 1-21, janv. 2008.
MINOR (D.L.) Jr - The Neurobiologist's Guide to Structural Biology : A Primer on Why Macromolecular Structure Matters and How to Evaluate Structural Data. - Neuron, 54, p. 511-533, 24 mai 2007.
SCHMIDT (A.) - LAMZIN (S.) - From atoms to proteins. - Cell. Mol. Life Sci., 64, p. 1959-1969 (2007).
Pour une étude approfondie, on pourra consulter les revues de synthèse ci-dessous
Crystallography of complexes. - Acta Cryst D63, Part 1, janv. 2007.
Structural Proteomics IN Europe. - Acta Cryst D62, Part 10, oct. 2006.
Data collection and analysis. - Acta Cryst D62, Part 1, janv. 2006.
Model building and refinement. - Acta Cryst D62, vol. 11, déc. 2004.
Experimental Phasing. - Acta Cryst D59, vol. 11, nov. 2003.
High-throughput structure determination. - Acta Cryst D58, vol. 11, nov. 2002.
Une bibliographie plus générale en biologie structurale
* - http://www.bio3d-igbmc.u-strasbg.fr/
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