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1 - PROTÉINES ET PEPTIDES

2 - RMN DES PROTÉINES EN SOLUTION

3 - CALCUL DES STRUCTURES

Article de référence | Réf : AF6608 v1

Structure des protéines par RMN

Auteur(s) : Thérèse MALLIAVIN, Frédéric DARDEL

Date de publication : 10 janv. 2002

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Auteur(s)

  • Thérèse MALLIAVIN : Chargé de recherches au CNRS - Laboratoire de biochimie théorique, Institut de biologie physico-chimique (IBPC)

  • Frédéric DARDEL : Directeur de recherches au CNRS, responsable d’équipe - Laboratoire de cristallographie et RMN biologiques, faculté de pharmacie, université Paris-V

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INTRODUCTION

Les protéines sont des polypeptides, formés à partir des vingt acides aminés naturels. Il existe deux types de conformation locale de la chaîne polypeptidique : une forme où le squelette est replié en hélice (hélice ), et une forme où le squelette est replié de manière à former une surface plus ou moins plane (plissée) (feuillet ).

La résonance magnétique nucléaire (RMN) des protéines étudie principalement le repliement de la chaîne polypeptidique dans l’espace. En cela, elle diffère essentiellement de la RMN pratiquée sur des molécules organiques, qui doit déterminer le graphe des liaisons covalentes. Une caractéristique importante des spectres RMN de protéines est leur extrême complexité, due au grand nombre de noyaux observables dans l’échantillon. Les différentes étapes de la détermination de structure de protéine par RMN sont : la préparation de l’échantillon, l’acquisition et le traitement du signal RMN produit par les noyaux observés, l’analyse et l’attribution des spectres, le calcul des coordonnées des atomes à partir des paramètres mesurés sur les spectres RMN.

L’étude d’une protéine peut se faire par RMN homonucléaire ou hétéronucléaire, suivant que l’on observe les noyaux protons seuls ou avec les noyaux carbones et /ou azotes. Les expériences RMN permettent l’observation des couplages scalaires et dipolaires entre spins. L’observation du transfert d’aimantation, par couplage dipolaire, produit des effets Overhauser nucléaires (nOe) entre noyaux situés à moins de 5 Å l’un de l’autre, et permet l’estimation des distances entre les noyaux observés. Mais la RMN homonucléaire présente certaines limitations pour l’étude des protéines en solution, à cause du taux de superposition des pics sur les spectres et du mauvais transfert d’aimantation entre protons par couplage scalaire. Ces problèmes, qui rendaient difficile l’utilisation de la RMN pour l’étude de protéines de taille supérieure à cent résidus, ont été réduits par l’utilisation des propriétés RMN de noyaux autres que le proton. En effet, des noyaux différents résonnent dans des gammes de fréquences différentes, ce qui permet de résoudre les superpositions de déplacements chimiques. De plus, les constantes de couplage hétéronucléaires améliorent la sensibilité du couplage scalaire.

L’attribution par RMN hétéronucléaire peut s’effectuer à l’aide d’échantillons simplement marqués 15N ou d’échantillons doublement marqués (15N, 13C). Sur une protéine marquée 15N, la stratégie est basée sur les expériences 2D HSQC ou HMQC (« heteronuclear single /multiple quantum correlation ») qui permettent d’observer les pics de corrélation dus au couplage scalaire entre l’hydrogène amide et l’azote de chaque résidu. La stratégie d’attribution basée sur le double marquage utilise, elle, exclusivement les couplages scalaires homo- et hétéronucléaires. Pour tenter d’augmenter la limite de taille des protéines étudiées, en sus du marquage 15N et 13C, 70 à 100 % des protons sont remplacés par des deutériums, pour diminuer la fuite de l’aimantation due aux interactions dipolaires entre protons. La diminution de la relaxation transverse à l’aide de l’expérience TROSY (« transverse relaxation-optimized spectroscopy ») permet également de repousser cette limite.

L’interaction entre deux molécules peut être étudiée par titrage à l’aide d’expériences 2D HSQC, enregistrées pour différents rapports de concentration des deux molécules, et en suivant les variations de déplacements chimiques. Il est aussi possible d’observer l’échange d’un ligand entre sa forme libre et sa forme liée à un récepteur ou de mesurer les coefficients de diffusion translationnelle à l’aide de gradients de champ B0 . La variation de déplacements chimiques en fonction de la variation de pH, ou de paramètres thermodynamiques comme la température ou la pression, permet de sonder les différents aspects de la stabilité d’une structure de protéine. Les intermédiaires du repliement d’une protéine peuvent aussi être caractérisés par l’échange des hydrogènes amides avec le deutérium de l’eau lourde. Enfin, une interprétation qualitative des déplacements chimiques en fonction de la structure primaire de la molécule permet la détection des structures secondaires hélice α ou feuillet β.

La RMN est une méthode de choix pour l’étude systématique, et au niveau atomique, de la dynamique interne moléculaire, pour des échelles de temps allant de la nanoseconde à la milliseconde suivant les expériences utilisées.

Le calcul de la structure d’une protéine à partir des paramètres RMN est la détermination d’un ensemble de conformères de la molécule, qui s’effectue dans le cadre du formalisme de la mécanique classique empirique. Un terme harmonique est ajouté dans l’énergie potentielle, qui permet d’appliquer à la structure les contraintes provenant des mesures de couplages scalaires ou dipolaires. La relation entre les paramètres RMN et les paramètres géométriques de la protéine étant assez qualitative, les contraintes sont donc appliquées sous forme d’intervalles plus ou moins larges. L’optimisation de la structure d’une protéine sous les contraintes géométriques déduites de la RMN est basée sur l’utilisation d’un protocole de recuit simulé, utilisant les algorithmes de dynamique moléculaire développés dans le cadre de la modélisation moléculaire classique empirique.

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DOI (Digital Object Identifier)

https://doi.org/10.51257/a-v1-af6608


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Le lecteur est invité à se reporter également à la partie Pour en savoir plus de l’article consacré à la RMN [Doc. P 2 880].

BIBLIOGRAPHIE

  • (1) - CANTOR (C.R.), SCHIMMEL (P.R.) -   Biophysical Chemistry Part II.  -  WH Freeman et Company (1980).

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  • (3) - JANIN (J.), DELEPIERRE (M.) -   Biologie structurale. Principes et méthodes biophysiques.  -  Hermann Méthodes (1994).

  • (4) - CAVANAGH (J.), FAIRBROTHER (W.J.), PALMER III (A.G.), SKELTON (N.J.) -   Protein NMR Spectroscopy : principles and practice.  -  Academic Press (1996).

  • (5) - RUTLEDGE (D.N.) (Ed.) -   Signal treatment and signal processing in NMR.  -  Elsevier (1996).

  • (6) - THERET (I.), BALADI (S.), COX (J.A.), SAKAMOTO (H.), CRAESCU (C.T.) -   Sequential calcium-binding to the regulatory domain of calcium vector protein reveals functional asymmetry and a novel mode of structural rearrangement....

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