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Article

1 - MESURE DE LA PHASE EN OPTIQUE PAR INTERFÉROMÉTRIE

2 - HOLOGRAPHIE

3 - MICROSCOPIE PAR TOMOGRAPHIE 3D : MODÈLE PAR PROJECTION OU DIFFRACTIF

4 - DISPOSITIF EXPÉRIMENTAL

5 - TOMOGRAPHIE À RÉSOLUTION ISOTROPE

6 - DISPOSITIFS COMMERCIAUX

7 - CONCLUSION

8 - GLOSSAIRE

Article de référence | Réf : P955 v1

Dispositif expérimental
Imagerie microscopique 3D de phase - Méthode d’imagerie sans marquage

Auteur(s) : Matthieu DEBAILLEUL, Bruno COLICCHIO

Date de publication : 10 nov. 2018

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RÉSUMÉ

L'imagerie 3D de phase est une alternative sans marquage à la microscopie de fluorescence. L'holographie numérique permet d'accéder à une information quantitative en phase, mais souffre d'une résolution limitée en 3D. Cet article présente la tomographie diffractive qui se base sur l'holographie en améliorant la résolution tridimensionnelle des images et fournit l'indice de réfraction et l'absorption dans le volume d’un spécimen. Cette technique est un complément intéressant à l'imagerie de fluorescence comme mode d'imagerie alternatif ou complémentaire. Les principes de l’holographie, de la tomographie et des exemples expérimentaux sont présentés et discutés.

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ABSTRACT

Microsocopic 3D phase imaging Unstained imaging method

3D phase imaging is a non-stain alternative to fluorescence microscopy. Digital holography provides access to quantitative phase information, but suffers from a limited 3D resolution. This article presents diffractive tomography based on holography with improved three-dimensional resolution of images, and which provides the refractive index and absorption in the bulk of a specimen. This technique is useful for fluorescence imaging as an alternative or a complementary imaging method. The principles of holography, and tomography are discussed, and experimental examples are presented.

Auteur(s)

  • Matthieu DEBAILLEUL : Ingénieur de recherche à l’Institut de recherche en informatique, mathématiques, automatique et signal (IRIMAS), Université de Haute-Alsace, Mulhouse, France

  • Bruno COLICCHIO : Maître de conférences à l’Institut de recherche en informatique, mathématiques, automatique et signal (IRIMAS), Université de Haute-Alsace, Mulhouse, France,

INTRODUCTION

En microscopie classique, lors de l’utilisation d’un système d’illumination-détection incohérent, l’image enregistrée résulte d’une interaction complexe entre l’illumination incohérente et le spécimen (objet). Le contraste observé permet d’étudier efficacement la morphologie, mais ne donne pas directement d’information quantitative sur les caractéristiques d’un spécimen.

Pour surmonter ces problèmes, notamment en biologie, les techniques employées nécessitent souvent un marquage fonctionnel des échantillons comme pour les microscopies de fluorescence, confocale, STED (Stimulated-Emission-Depletion), PALM (Photo-Activated Localization Microscopy), SIM (Structured Illumination Microscopy), ou leurs variantes. L’imagerie basée sur les marqueurs fluorescents est aujourd’hui la technique de choix employée en imagerie microscopique, grâce à la grande variété de fluorophores développés et aux résolutions atteintes. Le STED et le PALM ont notamment été récompensés par le prix Nobel en 2014. Cependant, ces modes d’imagerie peuvent parfois poser des problèmes (phototoxicité, photoblanchiment, densité d’énergie importante) et pour les scientifiques ne pouvant utiliser ces systèmes, d’autres types de microscopie, sans marquage, doivent être utilisés. Il existe différents types d’imagerie sans marquage : CARS (Coherent Anti-Stokes Raman Scattering), effet Raman, génération de second harmonique ou encore mesure de phase. Les techniques de génération d’harmoniques ou basées sur l’effet Raman permettent d’observer un contraste basé sur les propriétés optiques du spécimen, mais nécessitent une instrumentation coûteuse associée à une mise en œuvre délicate (laser femtoseconde).

L’holographie et la tomographie diffractive s’appuient sur une mesure du changement de phase induit sur l’onde d’illumination par l’échantillon, mais à l’inverse du DIC (Differential Interference Contrast) ou du contraste de phase, elles permettent d’accéder à une mesure quantitative de l’indice de réfraction et/ou de la phase. Cet article présente les concepts nécessaires à la compréhension de ce type de mesure et leur réalisation avec des montages interférométriques et tomographiques. En se basant sur les principes de l’holographie numérique et après une étape de traitements numériques, il est possible d’obtenir une série de données par tomographie, nécessaires à la résolution d’un problème inverse lié au mécanisme de formation de l’image dans un microscope. La solution de ce problème inverse permet la reconstruction d’une image de l’absorption et de l’indice optique local d’un spécimen 3D.

Afin de comprendre le mécanisme de formation d’image, les notions de propagation d’une onde lumineuse en utilisant l’espace de Fourier (spectre spatial) et le principe du spectre angulaire associé sont présentés en première partie, pour aboutir à la formulation des modèles directs (projectif et diffractif).

La microscopie holographique est présentée, et la limite de résolution est étudiée grâce au contenu fréquentiel (bande passante). La tomographie est décrite avec un montage expérimental et des mesures sur des spécimens.

Enfin, des moyens pour améliorer la résolution de telles images sont également présentés au niveau expérimental et algorithmique.

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KEYWORDS

holography   |   microscopy   |   optical index

DOI (Digital Object Identifier)

https://doi.org/10.51257/a-v1-p955


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4. Dispositif expérimental

La mesure en phase et amplitude du champ optique diffracté repose classiquement sur un montage de type interférométrique associé à un système de balayage angulaire de l’illumination et/ou rotation. La figure 15 détaille un interféromètre de type Mach-Zehnder. Une source laser est divisée par un séparateur fibré en une onde d’illumination et une onde de référence. Ces deux ondes sont injectées dans des fibres optiques monomodes qui permettent d’ajuster la différence de chemin optique.

L’onde d’illumination est collimatée, puis réfléchie par le dispositif rotatif M1 (paires de miroirs galvanométriques, miroir unique actionné par moteurs, DMD, SLM...) qui permet de contrôler l’angle d’illumination : la lentille de balayage L1 focalise l’onde d’illumination dans le plan focal arrière du condenseur et une rotation du miroir entraîne alors un changement d’angle de l’onde plane illuminant l’objet. La zone illuminée est limitée par le diaphragme de champ (DC1) proche du miroir M1.

Un objectif corrigé à l’infini associé à une lentille de tube collecte l’onde diffractée. Les deux lentilles finales permettent d’ajuster le grandissement et donc de contrôler l’échantillonnage sur la caméra. Un diaphragme DC2 effectue un filtrage dans l’espace de Fourier, afin d’éliminer les réflexions parasites.

Le système permet d’acquérir des hologrammes h (x, y), comme vu précédemment avec l’équation (13), et permet également de varier l’angle d’illumination.

4.1 Comparaison holographie et tomographie diffractive ToRI

La figure 16 illustre la différence dans l’extension et le remplissage de l’espace de Fourier avec un support obtenu expérimentalement sur un nombre limité d’hologrammes. Le nombre d’acquisition doit être suffisamment important pour assurer l’échantillonnage dans les hautes fréquences, moins dense, ce qui permet en contrepartie de moyenner l’information redondante.

Comme présenté sur la figure 17,...

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BIBLIOGRAPHIE

  • (1) - ERSOY (O.K.) -   Diffraction, Fourier optics and imaging.  -  John Wiley and Sons (2006).

  • (2) - VERRIER (N.), ATLAN (M.) -   Off-axis digital hologram reconstruction : some practical considerations.  -  Appl Opt., AO, DOI : 10.1364/AO.50.00H136, 50(34), p. H136-H146 (2011).

  • (3) - LIU (H.), BAILLEUL (J.), SIMON (B.), DEBAILLEUL (M.), COLICCHIO (B.), HAEBERLÉ (O.) -   Tomographic diffractive microscopy and multiview profilometry with flexible aberration correction.  -  Applied optics, 53(4), p. 748-755 (2014).

  • (4) - DUBOIS (F.), REQUENA (M.-L.N.), MINETTI (C.), MONNOM (O.), ISTASSE (E.) -   Partial spatial coherence effects in digital holographic microscopy with a laser source.  -  Appl. Opt., AO, DOI : 10.1364/AO.43.001131, 43(5), p. 1131-1139 (2004).

  • (5) - KIM (M.K.) -   Principles and techniques of digital holographic microscopy.  -  SR, SPIVJ2, DOI : 10.1117/6.0000006, 1(1), p. 018005 (2010).

  • ...

1 Brevets

Method and apparatus for simultaneous amplitude and quantitative phase contrast imaging by numerical reconstruction of digital holograms WO2000020929A1

Digital holographic microscope with fluid systems WO2014044823A1

Digital holographic microscope with electro-fluidic system, said electro-fluidic system and methods of use EP3196631A1

Apparatus and method for digital holographic imaging WO2003048868A1

Method for and use of digital holographic microscopy and imaging on labelled cell samples US8937756B2

Holographic microscopy and method to investigate nano-sized objects WO2010037861A1

Digital holographic device WO2015118475A1

Optical system for a holographic microscope US20130003073A1

Common-mode digital holographic microscope US20160131882A1

Digital holography three-dimensional imaging apparatus and digital holography three-dimensional imaging method US9599960B2

Procédé de détermination de l’état d’une cellule EP3274694A1

Microscope générant une représentation tridimentionnelle d’un objet et images générées par ce miscroscope FR2782173A1

HAUT DE PAGE

2 Annuaire

Lyncée Tec – Digital Holographic Microscopes https://www.lynceetec.com/

Phasics, the phase control company http://phasicscorp.com/

Qmod Holographic And Fluorescence Microscopy. In One Single System http://www.ovizio.com/

iPrasense – Live Cell Imaging http://www.iprasense.com/

Nanolive – label-free 3D live cell imaging technology https://nanolive.ch/...

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