Bibliographie & annexes
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RÉSUMÉ
Les progrès réalisés dans les domaines de la génétique, de la biochimie et de la biophysique ont permis de déterminer la structure et le fonctionnement des enzymes, d’améliorer leur production et de développer des tests innovants. Les mesures d’activité ou d’affinité enzymatiques sont plus performantes et écologiques. Cet article présente des techniques couramment utilisées dont l’amélioration a été accompagnée de la miniaturisation des essais. Des appareils avec divers systèmes de détection mesurent de très petites quantités de substrat ou de produit lors d’une réaction enzymatique, permettant une accélération de l’efficacité des recherches avec des gains de temps et financiers précieux.
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Advances in the fields of genetics, biochemistry and biophysics allowed to determine the structure and functioning of enzymes, to improve their production and to develop innovative tests. Measurements of enzymatic activity or affinity are more efficient and ecological. This article presents commonly used techniques whose improvement has been accompanied by the miniaturization of the tests. Devices with various detection systems measure very small quantities of substrate or product during an enzymatic reaction, allowing an acceleration of the efficiency of research with valuable time and financial savings.
Auteur(s)
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Julien DUMOND : Docteur en virologie enzymologie - Consultant en entreprises pharmaceutiques, Metz, France
-
Serge KIRKIACHARIAN : Docteur ès sciences physiques, Pharmacien - Professeur émérite de chimie thérapeutique de la faculté des sciences pharmaceutiques et biologiques de l’université Paris Sud - Praticien hospitalier chef de service honoraire des hôpitaux de Paris, France
INTRODUCTION
Depuis le début des années 1990, des progrès remarquables ont été réalisés dans de nombreux domaines scientifiques parmi lesquels il convient de citer :
-
la biologie moléculaire dans la connaissance des génomes, le clonage, les techniques expérimentales, l’élaboration et l’utilisation des vecteurs ;
-
la microbiologie avec la détermination de diverses souches d’hôtes et de milieux de culture ;
-
la biochimie avec la mise au point de colonnes en chromatographie ;
-
la biophysique avec le couplage possible entre la résonance plasmonique de surface ou l’électrophorèse bidimensionnelle sur gel et la spectrométrie de masse permettant d’optimiser la production et la purification des protéines et des enzymes ;
-
la détermination accélérée de la structure spatiale des protéines et des enzymes faisant appel aux applications de l’intelligence artificielle.
Dès lors, l’accès à une meilleure connaissance des enzymes et l’optimisation de leur production et de leur purification sont devenus plus accessibles.
En parallèle, des améliorations ont été réalisées au niveau des tests de mesure d’activité enzymatique et des essais permettant de qualifier et de quantifier la liaison entre une enzyme et un effecteur.
Ces diverses techniques sont ainsi de plus en plus résolutives, fiables et écologiques. Elles ont permis d’accélérer les recherches notamment dans divers domaines thérapeutiques. Il convient de citer à titre d’exemple la rapidité remarquable du développement d’inhibiteurs de kinases en oncologie, en raison de la genèse rapide de molécules chimiques ou biologiques couplée à des essais sur cibles très résolutifs et également rapides. Alors qu’il y a une trentaine d’années, il n’existait pratiquement pas de projets de recherche thérapeutique ciblant ces enzymes, leur nombre est de nos jours si élevé, que l’accès à l’ensemble des médicaments mis sur le marché ciblant entre autres les kinases devient plus ardu. Dans ce contexte, cette revue propose une vue d’ensemble non exhaustive des techniques et des protocoles de purification et de mesure d’activité enzymatique.
Le lecteur trouvera en fin d’article un glossaire et un tableau des sigles et des notations utilisés.
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MOTS-CLÉS
techniques biochimiques et biophysiques tests d'activité enzymatique affinité miniaturisation des essais
KEYWORDS
biochemical and biophysical techniques | enzyme activity assays | affinity | assay miniaturization
DOI (Digital Object Identifier)
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Conclusion3. Miniaturisation des essais : utilisation de microplaques
3.1 Microplaques et multipipettes
Les chercheurs disposent d’un grand choix de microplaques de différentes marques, le choix au niveau des plaques 96 et 384 puits est important.
Des plaques blanches sont généralement utilisées pour les mesures de bio/chimiluminescence. Des plaques noires sont utilisées pour les mesures de fluorescence, elles présentent un faible bruit de fond de fluorescence et minimisent la dispersion lumineuse.
Des surfaces polystyrène non traitées (ou fixation moyenne) sont de nature hydrophobe et lient les biomolécules par interactions passives. Elles sont principalement adaptées à l’immobilisation de grosses molécules telles que les anticorps.
Les surfaces de fixation importantes peuvent permettre de lier les molécules moyennes (> 10 kDa) et les grosses biomolécules possédant des groupes ioniques et/ou des régions hydrophobes.
Les surfaces non liantes sont utilisées pour créer une surface hydrophile qui minimise les interactions moléculaires. Elles permettent de réduire les liaisons de protéines et d’acides nucléiques à faible concentration et d’augmenter le rapport signal/bruit.
En fonction du mode de lecture effectué par l’appareillage, il existe des microplaques fond plat pour les lectures de plaque par le fond. Les fonds ronds améliorent le mélange et le lavage.
Des microplaques demi-puits sont également disponibles pour les essais utilisant des volumes réduits. Elles permettent d’économiser réactifs et composés.
Avec les microplaques sont apparues les multipipettes (8, 12 et 16 canaux) pouvant être électroniques. Elles permettent de distribuer avec grande précision et rapidité les différentes solutions sur la plaque quand les micro-volumes sont constants.
HAUT DE PAGE3.2 Appareils de mesure
Les appareils de mesure se sont adaptés aux plaques multipuits, des 96 puits utilisés couramment par les laboratoires académiques et laboratoires privés de recherche aux 1 536 puits retrouvés principalement dans les entreprises spécialisées. En 20 ans, il a fallu passer de la cuve unique avec une mesure d’activité à effectuer à la microplaque avec 96 (à 1 536) mesures à réaliser automatiquement sur un temps très court.
Les appareils de mesure ont été adaptés aux plaques et un seul appareil...
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BIBLIOGRAPHIE
-
(1) - GAILLARDIN (C.), TINSLEY (C.R.) - Génétique moléculaire. - AgroParisTech, Cursus Ingénieur Agronome, 1re année, Module de Biologie (2007).
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(2) - WURM (D.J.) et al - The E. coli pET expression system revisited-mechanistic correlation between glucose and lactose uptake. - Appl. Microbiol. Biotechnol., 100(20), p. 8721-8729 (2016).
-
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(4) - DILWORTH (M.V.) et al - Microbial expression systems for membrane proteins. - Methods, S1046-2023(17), p. 30377-30378 (2018).
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(5) - HOU (C.) et al - Weak anion and cation exchange mixed-bed microcolumn for protein separation. - J. Sep. Sci., 33(21), p. 3299-3303 (2010).
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