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RÉSUMÉ
Les progrès réalisés dans les domaines de la génétique, de la biochimie et de la biophysique ont permis de déterminer la structure et le fonctionnement des enzymes, d’améliorer leur production et de développer des tests innovants. Les mesures d’activité ou d’affinité enzymatiques sont plus performantes et écologiques. Cet article présente des techniques couramment utilisées dont l’amélioration a été accompagnée de la miniaturisation des essais. Des appareils avec divers systèmes de détection mesurent de très petites quantités de substrat ou de produit lors d’une réaction enzymatique, permettant une accélération de l’efficacité des recherches avec des gains de temps et financiers précieux.
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Lire l’articleAuteur(s)
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Julien DUMOND : Docteur en virologie enzymologie - Consultant en entreprises pharmaceutiques, Metz, France
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Serge KIRKIACHARIAN : Docteur ès sciences physiques, Pharmacien - Professeur émérite de chimie thérapeutique de la faculté des sciences pharmaceutiques et biologiques de l’université Paris Sud - Praticien hospitalier chef de service honoraire des hôpitaux de Paris, France
INTRODUCTION
Depuis le début des années 1990, des progrès remarquables ont été réalisés dans de nombreux domaines scientifiques parmi lesquels il convient de citer :
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la biologie moléculaire dans la connaissance des génomes, le clonage, les techniques expérimentales, l’élaboration et l’utilisation des vecteurs ;
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la microbiologie avec la détermination de diverses souches d’hôtes et de milieux de culture ;
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la biochimie avec la mise au point de colonnes en chromatographie ;
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la biophysique avec le couplage possible entre la résonance plasmonique de surface ou l’électrophorèse bidimensionnelle sur gel et la spectrométrie de masse permettant d’optimiser la production et la purification des protéines et des enzymes ;
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la détermination accélérée de la structure spatiale des protéines et des enzymes faisant appel aux applications de l’intelligence artificielle.
Dès lors, l’accès à une meilleure connaissance des enzymes et l’optimisation de leur production et de leur purification sont devenus plus accessibles.
En parallèle, des améliorations ont été réalisées au niveau des tests de mesure d’activité enzymatique et des essais permettant de qualifier et de quantifier la liaison entre une enzyme et un effecteur.
Ces diverses techniques sont ainsi de plus en plus résolutives, fiables et écologiques. Elles ont permis d’accélérer les recherches notamment dans divers domaines thérapeutiques. Il convient de citer à titre d’exemple la rapidité remarquable du développement d’inhibiteurs de kinases en oncologie, en raison de la genèse rapide de molécules chimiques ou biologiques couplée à des essais sur cibles très résolutifs et également rapides. Alors qu’il y a une trentaine d’années, il n’existait pratiquement pas de projets de recherche thérapeutique ciblant ces enzymes, leur nombre est de nos jours si élevé, que l’accès à l’ensemble des médicaments mis sur le marché ciblant entre autres les kinases devient plus ardu. Dans ce contexte, cette revue propose une vue d’ensemble non exhaustive des techniques et des protocoles de purification et de mesure d’activité enzymatique.
Le lecteur trouvera en fin d’article un glossaire et un tableau des sigles et des notations utilisés.
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MOTS-CLÉS
techniques biochimiques et biophysiques tests d'activité enzymatique affinité miniaturisation des essais
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Miniaturisation des essais : utilisation de microplaquesArticle inclus dans l'offre
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2. Méthodes de détection et d’élaboration de substrats ou de kits très spécifiques
2.1 Différentes méthodes de détection et de mesure d’affinité
Un test d’activité enzymatique est fondé sur des propriétés physicochimiques spécifiques du produit formé à partir du substrat et dont l’apparition est mesurée. La disparition d’un substrat avec des propriétés physicochimiques spécifiques peut être également suivie. Quelle que soit la méthode utilisée, il faut impérativement qu‘une seule des deux molécules (produit ou substrat) possède les propriétés physicochimiques nécessaires à la quantification de la vitesse de réaction. Ces propriétés permettent de quantifier l’apparition du produit ou la disparition du substrat. Ces molécules aux propriétés physicochimiques particulières résultent d’un travail de recherche quand ces propriétés ne sont pas naturelles. Depuis quelques décennies, des entreprises innovantes se sont spécialisées dans le développement de telles substances.
HAUT DE PAGE2.1.1 Propriétés physicochimiques recherchées pour les dosages enzymatiques
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La spectrophotométrie d’absorption moléculaire dans l’UV proche ou le visible est la capacité de la molécule à absorber un rayonnement à une longueur d’onde donnée et à n’en laisser passer qu’une fraction. La loi de Beer Lambert permet de relier l’intensité du faisceau transmis I (t) à l’intensité du rayonnement incident I 0 , afin de déduire l’absorbance :
L’absorbance est obtenue par la formule suivante :
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Méthodes de détection et d’élaboration de substrats ou de kits très spécifiques
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BIBLIOGRAPHIE
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(1) - GAILLARDIN (C.), TINSLEY (C.R.) - Génétique moléculaire. - AgroParisTech, Cursus Ingénieur Agronome, 1re année, Module de Biologie (2007).
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(2) - WURM (D.J.) et al - The E. coli pET expression system revisited-mechanistic correlation between glucose and lactose uptake. - Appl. Microbiol. Biotechnol., 100(20), p. 8721-8729 (2016).
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(3) - SHIMIZU (Y.) et al - Cell-free translation reconstituted with purified components. - Nature, 19, p. 751-755 (2001).
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(4) - DILWORTH (M.V.) et al - Microbial expression systems for membrane proteins. - Methods, S1046-2023(17), p. 30377-30378 (2018).
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(5) - HOU (C.) et al - Weak anion and cation exchange mixed-bed microcolumn for protein separation. - J. Sep. Sci., 33(21), p. 3299-3303 (2010).
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(6) - NOVOTNY...
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