Article de référence | Réf : E4327 v1

Sources lasers développées pour la MMP
Sources lasers en microscopie optique pour les sciences de la vie

Auteur(s) : Claire LEFORT

Date de publication : 10 oct. 2020

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RÉSUMÉ

La microscopie optique est une technique de caractérisation incontournable dans les sciences de la vie (biologie médicale, animale ou végétale, bactériologie, virologie…). Le standard de référence est la microscopie confocale ; la microscopie multiphotonique (MMP) apporte une spécificité spectrale associée à une propriété unique de sectionnement optique d’objets biologiques. De nouvelles sources lasers ont été développées, contribuant aux avancées de la MMP. Cet article présente les méthodes les plus utilisées en routine reposant sur le phénomène de fluorescence, et passe en revue les sources lasers spécifiquement mises en œuvre pour la MMP, avec leurs atouts et leurs limitations.

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Auteur(s)

  • Claire LEFORT : Chargée de Recherche, CNRS, - Institut de Recherche XLIM, - CNRS, Université de Limoges, UMR 7252, Limoges, France

INTRODUCTION

La microscopie optique est une méthode d’observation incontournable dans de nombreuses disciplines des sciences de la vie. Cette technique d’imagerie est la seule proposant un protocole peu invasif mettant en jeu des interactions lumière-matière, qui minimisent les risques d’endommagement ou de destruction de la cible imagée, tout en cumulant des performances de résolution subcellulaire. Elle s’inscrit donc parmi les techniques essentielles dans de nombreuses disciplines des sciences de la vie, pour aller observer des phénomènes biologiques dynamiques ou des structures vivantes aux échelles toujours plus petites. Dans certains cas, les méthodes permettant d’atteindre les échelles nanométriques comme la microscopie électronique ou bien la microscopie à force atomique sont irremplaçables pour l’imagerie du vivant ; ce sujet représentant la limite du présent thème ne sera pas abordé ici. Dans la suite de cet article, les termes de microscopie ou microscopie optique seront employés de façon équivalente.

Quatre entreprises se partagent principalement le marché de la microscopie optique pour les sciences du vivant : Olympus, Nikon, Leica et Zeiss. Les systèmes de microscopie proposés à la vente incluent le plus souvent les dernières avancées technologiques de microscopie, qui concernent principalement les sources d’excitation, les systèmes de détection et d’acquisition ou de traitement des images ou encore les systèmes de balayage. Des solutions adaptées à un besoin spécifique peuvent aussi être proposées. C’est par exemple le cas pour certaines méthodes de microscopie optique super-résolues.

Dans ce contexte, où le besoin se révèle en même temps que les avancées technologiques apparaissent, l’importance des sources lasers d’excitation en microscopie optique a pris une nouvelle dimension depuis les années 2000. Le présent article propose d’abord un état des lieux des méthodes de microscopie optique actuellement utilisées en routine, notamment dans les laboratoires de biologie et par les plateformes d’imagerie du vivant. Il s’agit ensuite de faire un lien entre le besoin en microscopie optique pour les sciences de la vie et les innovations laser récentes. En effet, les concepts de physique impliqués dans ces innovations peuvent reposer sur des principes parfois sophistiqués, pas toujours simples à conceptualiser expérimentalement dans le contexte du besoin applicatif de microscopie pour les sciences de la vie. Ainsi, les processus optiques impliqués dans ces méthodes de microscopie sont présentés théoriquement. Enfin, le rôle et l’importance de certains paramètres physiques des sources lasers pour optimiser les processus impliqués en MMP pour les sciences du vivant sont détaillés. Une liste non exhaustive des sources lasers ayant été spécialement développées pour des applications à la MMP conclut cet article qui propose également le portrait-robot d’une source laser idéale pour la microscopie pour les sciences de la vie.

Le lecteur trouvera en fin d’article un glossaire et un tableau des symboles utilisés.

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KEYWORDS

fluorescence microscopy   |   life sciences imaging   |   multiphotonmicroscopy   |   laser sources

DOI (Digital Object Identifier)

https://doi.org/10.51257/a-v1-e4327


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4. Sources lasers développées pour la MMP

4.1 Lasers usuels en MMP

Les sources laser implémentées sur les systèmes commerciaux de MMP actuels sont presque toutes du même type : un laser impulsionnel Ti:Sa. Comme précisé précédemment, ce système délivre des impulsions laser ayant des paramètres tout à fait adaptés à la MMP : gamme spectrale dans le proche infrarouge, durée d’impulsion femtoseconde et taux de répétition proche de 100 MHz. La valeur de 80 × 103 fera office de référence pour la partie suivante. Le marché de ces sources pour la MMP est principalement dominé par deux vendeurs : Coherent et Spectra Physics (compter environ 100 k€ pour cette source). Pour accéder aux modalités d’imagerie de type génération de troisième harmonique, une source IR émettant des impulsions laser entre 1 000 et 1 500 nm est nécessaire. Dans ce cas, l’acquisition d’un système reposant sur une technologie de type oscillateur ou amplificateurs paramétrique optique alimenté par un Ti:Sa doit être envisagée. Pour ce module commercial, il faut compter environ 100 k€ supplémentaires, et des contraintes techniques majeures sur les optiques et leur gammes spectrales de transparences. Le coût de la source laser dans un système commercial de MMP représente quasiment la moitié du coût total pour cet investissement.

Parallèlement, de nombreuses technologies laser alternatives ont été développées durant ces 20 dernières années [E 6 455] ...

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BIBLIOGRAPHIE

  • (1) - MERTZ (J.) -   Introduction to Optical Microscopy.  -  Roberts & Company Publishers (2009).

  • (2) - HELL (S.W.) -   The 2015 super-resolution microscopy roadmap.  -  Journal of Physics D: Applied Physics, 48, 443001 (2015).

  • (3) - DIASPRO (A.) -   Confocal and Two-photon microscopy, Foundations, applications and advances.  -  Wiley-Liss Inc., New York (2002).

  • (4) - LAKOWICZ (J. R.) -   Principles of Fluorescence Spectroscopy.  -  3rd edn, Berlin : Springer (2006).

  • (5) - DENK (W.), STRICKLER (J. H.), WEBB (W. W.) -   Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.  -  Science, 248, 73-6 (1990).

  • (6) - SHEPPARD (C.), KOMPFNER (R.) -   Resonant scanning optical microscope.  -  Applied Optics, 17, 2879-2882 (1978).

  • ...

1 Site internet

On peut retrouver les spectres d’absorption linéaire des fluorophores les plus classiques en suivant l’un des liens ci-dessous :

Thermo Fisher Scientific : http://www.thermofisher.com › home › labeling-chemistry

Biosciences : https://www.bdbiosciences.com/en-us/applications/research-applications/multicolor-flow-cytometry/product-selection-tools/spectrum-viewer

Bio-Rad : https://www.bio-rad-antibodies.com/spectraviewer.html

On peut retrouver quelques spectres d’absorption biphotonique en suivant le lien : https://www.drbio.cornell.edu/cross_sections.html

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