Microscopie de fluorescence biomédicale

INTRODUCTION

1 - PRÉPARATIONS FLUORESCENTES

• 1.1 - Principe physique de la fluorescence moléculaire
  Figure 1 - Diagramme de Jablonski du principe de fluorescence
• 1.2 - Dissipation par FRET
• 1.3 - FRAP
• 1.4 - Molécules fluorescentes utilisées en microscopie
  Figure 2 - Classification des molécules biologiques et des stratégies de marquage. Pour chacune des familles des molécules biologiques, un exemple de sonde fluorescente est illustré ainsi que le complexe fluorescent produit
• 1.5 - Marquage des cibles biologiques
  Figure 3 - Spectres d'émission ou d'excitation des principales familles des sondes calciques fluorescentes Figure 4 - Techniques de marquage en immunofluorescence. Le principe est d'injecter une protéine que l'on veut détecter dans un animal (lapin, souris) pour lui faire produire des anticorps Figure 5 - Technique de protéine recombinante. Fusion des gènes de la protéine cible et d'une protéine fluorescente au sein d'un plasmide Figure 6 - Cycle des états de la Dronpa, protéine photo-convertible Figure 7 - Principe d'un biosenseur FRET Figure 8 - Principe de détection d'interaction de deux protéines par sonde BiFC Figure 9 - Principe du marquage d'un enzyme par chimie Click

2 - DISPOSITIFS OPTIQUES

• 2.1 - Microscope plein-champ
  Figure 10 - (a) Principe de montage d'un microscope de fluorescence, (b) détail de la séparation des faisceaux par un cube dichroïque Figure 11 - Chemin optique des microscopes droit et inversé
• 2.2 - Réponse impulsionnelle en microscopie de fluorescence
  Figure 12 - Modèle mathématique de la fonction point source (ou Point Spread Function PSF) vue sous deux angles différents
• 2.3 - Sources d'éclairage pour la microscopie de fluorescence
  Figure 13 - Spectre de puissance des sources usuelles d'excitation de fluorescence Figure 14 - Comparaison entre deux techniques d'excitation pour la fluorescence multicouleurs

3 - TECHNIQUES D'OBSERVATION D'OBJETS ÉPAIS

• 3.1 - Obstacles à l'observation directe
• 3.2 - Microscopie à feuille de lumière
  Figure 15 - Principe de la technique du feuillet de lumière (SPIM)

4 - TECHNIQUES DE MICROSCOPIE AVANCÉES

• 4.1 - Restriction de la zone explorée
  Figure 16 - Principe de montage d'un microscope confocal à balayage laser Figure 17 - Spectres d'excitation et d'émission en excitation conventionnelle et à deux photons. Le spectre d'excitation d'une molécule est reproduit en bleu, son spectre d'émission en vert. En excitation conventionnelle (a), l'excitation (flèche noire) est choisie au sein du spectre d'excitation et limite souvent la zone du spectre d'émission enregistrée (zone hachurée verte). En excitation à 2 photons (b), la longueur d'onde du laser d'excition (flèche rouge), est environ le double de celle d'un laser conventionnel. Elle est située en général hors du spectre d'émission, ce qui permet d'élargir la fenêtre d'acquisition. Le schéma (c) illustre la zone ponctuelle de flux intense où la fluorescence est excitée, au foyer de l'objectif Figure 18 - Principe du montage du microscope à deux photons en configuration descannée ou non descannée Figure 19 - Principe de montage du microscope confocal à disque tournant (Yokogawa Spinning Disk ) Figure 20 - Principe d'éclairage évanescent (TIRF) par prisme (a) ou par l'objectif (b)
• 4.2 - Techniques de super-résolution
  Figure 21 - Principe de la microscopie en illumination structurée (a) schéma de l'image diffractée normale (b) série d'images obtenues par un masque en 3 orientations et 3 phases différentes (c) image SIM reconstruite à partir des 9 images précédentes Figure 22 - Principe du montage optique de super-résolution avec deux objectifs. Microscopes I2M et I5M Figure 23 - Schéma de principe d'un masque en beignet en 2D (a) ou en 3D (b) Figure 24 - Séquence temporelle et représentation spectrale pour la mesure d'un point en STED Figure 25 - Séquence temporelle pour la mesure d'un point en GSD Figure 26 - Principe des techniques pointillistes (PALM et STORM)

5 - CAPTEURS D'IMAGE

• 5.1 - Détecteurs matriciels
  Figure 27 - Schéma d'un point de l'image d'un capteur CMOS : origine de l'accumulation de charges Figure 28 - Lecture des charges sur un capteur CCD et sur un capteur CMOS Figure 29 - Schéma d'une caméra à transfert de trame
• 5.2 - Détecteurs linéaires
  Figure 30 - Schéma de principe d'un photomultiplicateur (PMT) classique (a) et d'un PMT multi-anodes (b). La capture d'un photon sur la cathode produit un électron qui est accéléré puis amplifié par une cascade de dynodes pour fournir un courant sur l'anode. Dans le photomultiplicateur multi-anodes, la position du photon sur la cathode détermine l'anode qui reçoit le courant
• 5.3 - Capteurs ponctuels
• 5.4 - Capteurs résolus en temps

6 - ACTEURS INDUSTRIELS DE LA MICROSCOPIE À FLUORESCENCE

• 6.1 - Structure du secteur
  Figure 31 - Schéma des processus de développement technologique pour la microscopie de fluorescence
• 6.2 - Constructeurs de microscopes
• 6.3 - Caméras
• 6.4 - Périphériques
• 6.5 - Logiciels

7 - CONCLUSION

8 - GLOSSAIRE – DÉFINITIONS