Article

1 - PRÉPARATIONS FLUORESCENTES

2 - DISPOSITIFS OPTIQUES

3 - TECHNIQUES D'OBSERVATION D'OBJETS ÉPAIS

4 - TECHNIQUES DE MICROSCOPIE AVANCÉES

5 - CAPTEURS D'IMAGE

6 - ACTEURS INDUSTRIELS DE LA MICROSCOPIE À FLUORESCENCE

7 - CONCLUSION

8 - GLOSSAIRE – DÉFINITIONS

Article de référence | Réf : BIO7200 v1

Microscopie de fluorescence biomédicale

Auteur(s) : Léon ESPINOSA, Yves TOURNEUR

Date de publication : 10 mars 2015

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RÉSUMÉ

La microscopie de fluorescence nécessite d'une part un instrument spécifique et des molécules fluorescentes. Cet article expose ces deux aspects. Cette technique est majoritairement utilisée sur des échantillons biologiques. Les nombreuses sondes pour les molécules biologiques ainsi que les protéines de fusion fluorescentes comme la GFP sont présentées, ainsi qu'une large gamme de techniques : champ large, confocal, super résolution, coupes optiques, protection des échantillons, vidéo microscopie sur matériel vivant. Un tissu industriel dynamique s'est développé autour de grandes entreprises d'instrumentation, des constructeurs des périphériques (caméras, optomécanique, chimie) et des laboratoires de recherche biomédicale, d'optique, et des compagnies pharmaceutiques.

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ABSTRACT

Biomedical fluorescence microscopy

Fluorescence microscopy is a photonic technique that requires a specific instrument, and fluorescent substances. This article outlines both aspects. This technique is mainly used on biological samples. We describe a battery of probes targeting biological molecules, along with the use of fluorescent fusion proteins such as GFP. A wide range of techniques is described related to the benefits for ease of observation: wide field, confocal, super-resolution optical sections, sample protection, and video microscopy of living material. There is a dynamic industrial base, composed of large instrumentation companies, manufacturers of devices (cameras, optomechanics, chemistry), optical and biomedical research laboratories, and pharmaceutical companies.

Auteur(s)

  • Léon ESPINOSA : Docteur ès sciences - Ingénieur de recherche CNRS - Responsable du service de microscopie et de criblage du LCB (Laboratoire de Chimie Bactérienne) UMR CNRS 7283 Aix Marseille Université

  • Yves TOURNEUR : Ingénieur École Centrale de Lyon - Docteur ès sciences, chargé de recherche CNRS, laboratoire INSERM U1060 - Responsable de la plateforme Centre de quantimétrie, Université Claude Bernard Lyon 1

INTRODUCTION

Cet article décrit les principales techniques de la microscopie de fluorescence, les dispositifs commerciaux existants, et les technologies en développement. Le principal domaine d'utilisation de la microscopie de fluorescence est le domaine biomédical dans les applications de recherche fondamentale, appliquée, de diagnostic, de contrôle de qualité, etc. D'autres applications, en particulier en chimie et sciences des matériaux, utilisent les mêmes principes décrits ici du point de vue des applications des sciences de la vie. Actuellement, la microscopie de fluorescence permet d'étudier au niveau cellulaire et moléculaire les structures biologiques, leur fonctionnement et leurs interactions (division cellulaire, motilité, transport, sécrétion, communication neuronale, etc.).

La microscopie de fluorescence explore les domaines depuis l'ordre du nanomètre, avec les nouvelles techniques de super-résolution, jusqu'aux tailles millimétriques et, dans le domaine spectral, de l'ultraviolet (350 nm) au proche infrarouge (1 μm). Avec les capteurs courants, les temps d'enregistrement vont de la milliseconde à quelques secondes.

D'un point de vue industriel, le développement du secteur dépend d'une interaction dynamique entre les laboratoires de recherche fondamentale (utilisateurs), les laboratoires académiques de recherche en instrumentation, et les constructeurs. La microscopie de fluorescence se situe au carrefour de plusieurs techniques en évolution rapide. Des évolutions apparaissent dans les domaines de la chimie des sondes, des sources de lumière, des lasers, des dispositifs optomécaniques, des détecteurs de lumière, du traitement de signal et des possibilités de l'informatique. Des développements locaux peuvent se retrouver en un ou deux ans sous la forme d'un nouveau produit commercial. L'interaction avec tous ces domaines permet à la microscopie de fluorescence de s'étendre à de nouveaux champs, depuis l'étude moléculaire jusqu'à l'animal vivant. Nous avons choisi l'approche pluridisciplinaire dans la présentation de cet article.

Cette technique est assez universelle, généralement rapide à mettre en œuvre. Un de ses intérêts majeurs est l'extrême spécificité offerte par l'immuno- fluorescence et les protéines de fusion. Elle trouve ses limites dans la difficulté de disposer d'une sonde spécifique et d'explorer des objets épais (> 0,5 mm).

Elle s'applique maintenant en routine dans le domaine du diagnostic médical, de la recherche biomédicale et pharmaceutique, en chirurgie, et dans la recherche en instrumentation.

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KEYWORDS

fluorescent molecules   |   fluorescence microscope   |   super-resolution   |   Biomedical research   |   biomedical industry   |   Two-photon fluorescence microscopy   |   optical microscopy   |   fluorescence

DOI (Digital Object Identifier)

https://doi.org/10.51257/a-v1-bio7200


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BIBLIOGRAPHIE

  • (1) - MOJZISOVA (H.), BONNEAU (S.), BRAULT (D.) -   Structural and physico-chemical determinants of the interactions of macrocyclic photosensitizers with cells.  -  Eur. Biophys. J., vol. 36, no 8, p. 943-953, nov. 2007.

  • (2) - VALEUR (B.) -   Molecular fluorescence : principles and applications.  -  Wiley-VCH, Verlag GmbH, vol. 8 (2001).

  • (3) - HOLZINGER (M.), LE GOFF (A.), COSNIER (S.) -   Nanomaterials for biosensing applications : a review.  -  Front. Chem., vol. 2, p. 1-10, août 2014.

  • (4) - GIEPMANS (B.N.G.), ADAMS (S.R.), ELLISMAN (M.H.), TSIEN (R.Y.) -   The fluorescent toolbox for assessing protein location and function.  -  Science, vol. 312, no 5771, p. 217-224, avr. 2006.

  • (5) - SHANER (N.C.), STEINBACH (P.A.), TSIEN (R.Y.) -   A guide to choosing fluorescent proteins.  -  Nat. Methods, vol. 2, no 12, p. 905-909 (2005).

  • ...

1 Outils logiciels

Saisie d'image et pilotage des périphériques

Metamorph http://www.moleculardevices.comcom/Products/Software/Meta-Imaging-Series/MetaMorph.html

Pilotage des périphériques

Micro-manager https://www.micro-manager.org/

Traitement et analyse d'images

De nombreux logiciels libres sont disponibles pour le traitement d'images. Depuis le congrès IEEE de Barcelone en juin 2012, les éditeurs travaillent à leur interopérabilité

imageJ https://imagej.nih.gov/ij/

Fiji, autre distribution de imageJ, et ImgLib2 http://www.fiji.sc/Fiji http://www.fiji.sc/wiki/index.php/ImgLib2

Icy http://www.icy.bioimageanalysis.org/

Cell profiler et Cell profiler analyst http://www.cellprofiler.org/

Projet OME (Open Microscopy Environment) conversion de format et archivage de fichiers https://www.openmicroscopy.org/...

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