Article de référence | Réf : P1454 v1

Instrumentation
Chromatographie en phase liquide - Introduction

Auteur(s) : Jean-Luc VEUTHEY

Date de publication : 10 mars 2020

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RÉSUMÉ

Cet article se propose de faire le point sur l’évolution qu’a connue la chromatographie en phase liquide de 2004 à 2020 en termes d’instrumentation et de domaines d’applications. Plus particulièrement, la chromatographie liquide à ultra haute performance est désormais reconnue comme étant la méthode séparative de choix dans de nombreux domaines et cet article décrit la nature des nouvelles phases stationnaires, l’amélioration de l’instrumentation, les types de séparation développés pour de nouvelles applications ainsi que le traitement des données en termes de logiciels d’optimisation de méthode et de critères de validation.

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ABSTRACT

Liquid chromatography- Introduction

This article aims to describe the evolution that liquid chromatography has known from 2004 to 2020 in terms of instrumentation and fields of application. More particularly, ultra-high performance liquid chromatography is now recognized as the separation technique of choice in many fields and this article describes the nature of new stationary phases, the required instrumentation, types of separation developed for new applications as well as data treatment in terms of method optimization software and validation criteria.

Auteur(s)

  • Jean-Luc VEUTHEY : Professeur, Unité de Sciences Analytiques, Section des sciences pharmaceutiques, Université de Genève, Suisse

INTRODUCTION

La chromatographie en phase liquide (CPL) est devenue la technique analytique de référence dans de nombreux domaines requérant la séparation et la quantification de composés présents dans différentes matrices (environnementales, biologiques, chimiques, etc.). Cette technique est basée sur la différence de distribution des composés entre deux phases non miscibles : une phase mobile constituée d’un solvant et une phase stationnaire contenue dans une colonne. Les interactions mises en jeu, qui doivent avoir une cinétique rapide et être réversibles, peuvent être de différentes natures telles que de l’adsorption, du partage ou de l’échange d’ions par exemple. À la sortie de la colonne chromatographique, les composés séparés sont révélés en ligne au moyen d’un détecteur approprié. De nombreux détecteurs peuvent être utilisés et leur choix est fonction de la nature des composés séparés et des sensibilités requises. Les deux détecteurs les plus répandus aujourd’hui sont le spectrophotomètre UV-visible et le spectromètre de masse. Ce dernier a révolutionné l’usage de la CPL depuis le début du XXIe siècle de par ses extraordinaires propriétés en termes de sensibilité, de quasi-universalité, de sélectivité et d’informations structurelles pouvant être obtenues. La chromatographie en phase liquide a désormais largement remplacé la chromatographie en phase gazeuse, qui demeure toutefois la technique de choix pour l’analyse des composés volatils dans différents domaines tels que les produits pétroliers.

À partir du XXIe siècle, la CPL a également connu une importante évolution en termes d’instrumentation avec des systèmes de pompes pouvant délivrer la phase mobile à de très hautes pressions (jusqu’à 1 500 bar aujourd’hui), des volumes extra-colonne très réduits et des phases stationnaires de petite taille permettant de réaliser des séparations très rapides (moins d’une minute) ou/et avec une très grande capacité de pics. Cette technologie connue sous le nom de chromatographie liquide à ultra haute performance UHPLC (Ultra High Performance Liquid Chromatography) permet de répondre aux exigences requises par les autorités en termes de rapidité, de sensibilité et de coût d’analyse et elle est désormais répandue dans tous les domaines allant de l’analyse des fluides biologiques à celle des matrices environnementales.

Cet article se propose de faire le point sur cette nouvelle technologie en discutant la nature des phases stationnaires, l’amélioration de l’instrumentation, les types de séparation développés pour de nouvelles applications ainsi que le traitement des données en termes de logiciels d’optimisation de méthode et de critères de validation.

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DOI (Digital Object Identifier)

https://doi.org/10.51257/a-v1-p1454


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2. Instrumentation

Afin d’obtenir les performances chromatographiques attendues avec les phases stationnaires remplies de particules de petite taille, des modifications importantes de l’instrumentation ont été apportées à partir de 2004 avec la première commercialisation d’un appareil UHPLC. En effet, dans le cas de séparations rapides, l’utilisation des particules de petites tailles permet une réduction des dimensions des colonnes et une augmentation de la vitesse linéaire de la phase mobile, mais induit une grande perte de charge [P 1 494] [IN 187]. Ainsi, il est nécessaire d’avoir à disposition des instruments présentant les caractéristiques suivantes :

  • faible dispersion extra-colonne ;

  • haute fréquence d’acquisition du détecteur ;

  • faible volume de délai ;

  • réduction du temps d’injection ;

  • système de pompage à haute pression.

Les appareils commercialisés permettent désormais d’atteindre des pressions de l’ordre de 1 000 à 1 500 bars avec des volumes extra-colonnes très réduits de l’ordre de quelques microlitres

Comme mentionné précédemment, il est nécessaire d’avoir à disposition des méthodes chromatographiques de plus en plus sélectives et sensibles. Ainsi, la spectrométrie de masse (SM) est devenue la méthode de détection de choix dans tous les domaines. Les trois articles d’Arpino ...

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BIBLIOGRAPHIE

  • (1) - MARTIN (A.J.P.), SYNGE (R.L.M.) -   A new form of chromatogram employing two liquid phases. 1. A theory of chromatography 2. Application to the micro-determination of the higher monoamino-acids in proteins.  -  Biochemical Journal, 35, p. 1358-1368 (1941).

  • (2) - JENKINS (K.), DIEHL (D.), MORRISON (D.), MAZZEO (J.) -   Utilizing XBridge HPLC columns for method development at pH extremes : XBridge C18 columns provide outstanding phosphate buffer stability at pH 2, 7 and 12,  -  LC-GC Europe, 18 (9 Spec. Iss.) p. 42-43, (2005).

  • (3) - HOLCAPEK (M.), BIDWELL (C.W.) -   Handbook of Advanced Chromatography/Mass Spectrometry Techniques,  -  AOCS Press. Published by Elsevier Inc. (2017).

  • (4) - BU (X.), REGALADO (E.L.), HAMILTON (S.E.), WELCH (C.J.) -   The emergence of low-cost compact mass spectrometry detectors for chromatographic analysis.  -  TrAC, 82, p. 22-34 (2016).

  • (5) - FEKETE (S., GUILLARME (D.), SANDRA (P.), SANDRA (K.) -   Chromatographic, electrophoretic, and mass spectrometric methods for the analytical characterization of protein biopharmaceuticals,  -  ...

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