Bibliographie & annexes
Présentation
RÉSUMÉ
La protéomique est une science récente qui étudie les protéines, elle donne ainsi accès à l’expression génique d’une cellule, d’un tissu ou d’un organe, grâce à l'étude des protéines et de leurs modifications post-traductionnelles. Une analyse protéomique débute par l’extraction des protéines à partir de la matrice biologique, les conditions de cette préparation de l’échantillon, notamment le choix des agents de solubilisation, sont déterminantes. Les protéines sont ensuite séparées et purifiées par électrophorèse bidimensionnelle, puis leur analyse réalisée par spectrométrie de masse. Ces étapes sont généralement suivies de l’identification des protéines et de leur quantification par méthode différentielle ou absolue.
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Proteomics is a recent science which studies proteins and thus provides access to the genetic expression of a cell, tissue or organ, thanks to the study of proteins and their post-traductional modifications. Proteomic analysis starts with the extraction of proteins from the biological matrix; the conditions for this sample preparation and notably the choice of solubilizers are determining. The proteins are then separated and purified by two-dimensional electrophoresis and their analysis carried out by mass spectrometry. These stages are generally followed by the identification of proteins and their quantification by differential or absolute method.
Auteur(s)
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Alexia ORTIZ : Miniaturisation pour l'analyse, la synthèse et la protéomique (MSAP), USR CNRS 3290, Université de Lille 1 Sciences et technologies, Villeneuve d'Ascq
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Caroline TOKARSKI : Miniaturisation pour l'analyse, la synthèse et la protéomique (MSAP), USR CNRS 3290, Université de Lille 1 Sciences et Technologies, Villeneuve d'Ascq
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Christian ROLANDO : Miniaturisation pour l'analyse, la synthèse et la protéomique (MSAP), USR CNRS 3290, Université de Lille 1 Sciences et technologies, Villeneuve d'Ascq
INTRODUCTION
La protéomique est une science récente qui étudie les protéines. Le terme « protéome », proposé en 1995 , désigne l'ensemble des protéines exprimées par le génome d'une cellule, d'un tissu ou encore d'un organe à un moment précis de son développement.
Même si le séquençage du génome humain est aujourd'hui achevé, l'étude du génome comporte des limites. Sa connaissance ne permet pas d'appréhender la complexité du fonctionnement cellulaire. Un même génome conduit à l'expression de plusieurs protéomes en fonction des étapes du cycle cellulaire, de l'état physiopathologique de la cellule. Enfin, les protéines peuvent subir de nombreuses modifications indépendamment de la seule expression du gène codant. L'analyse protéomique permet donc une description dynamique de la régulation de l'expression génique, grâce à l'étude des protéines et de leurs modifications post-traductionnelles.
L'analyse protéomique trouve deux champs d'applications : d'une part, l'identification des protéines pour un organisme donné (localisation intracellulaire, interactions protéine-protéine) et, d'autre part, la connaissance des niveaux d'expression des protéines et des effets d'agents extérieurs (pathologies, traitements médicamenteux, facteurs environnementaux, etc.).
L'analyse protéomique repose principalement sur une méthodologie couplant l'électrophorèse bidimensionnelle (2D-PAGE), technique possédant un pouvoir résolutif très élevé, et la spectrométrie de masse. Une analyse protéomique classique peut ainsi se résumer par :
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extraction des protéines à partir d'un matériel biologique donné ;
-
séparation des protéines par électrophorèse ;
-
analyse de ces protéines par spectrométrie de masse.
Outre ces trois étapes, nous compléterons cette présentation par une description du traitement des données (interrogation de banques de données pour l'identification des protéines et/ou de leurs modifications), une introduction aux approches protéomiques basées sur des techniques alternatives, et pour finier sur les différentes approches d'une étude protéomique ainsi que les différentes techniques de quantification des protéines.
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Quantification3. Analyse et identification des protéines
3.1 Hydrolyse enzymatique des protéines
Cette étape d'hydrolyse enzymatique consiste à couper de manière contrôlée les protéines en peptides. Les protéines soumises à la digestion peuvent se trouver dans un milieu liquide ou incluses dans un gel d'électrophorèse qui sera excisé suite à la migration et détection des protéines. L'hydrolyse enzymatique est divisée en trois grandes étapes.
• La dénaturation/réduction qui permet de rompre les édifices tridimensionnels et les structures secondaires constitutives des protéines, et en particulier les ponts disulfures intra- et interprotéiques. Elle a lieu dans un milieu tamponné en présence d'agents chaotropes (trifluroéthanol 5 %, urée/thiourée 5/2 M) et d'agents réducteurs (DTT, entre 4 mM et 300 mM). En utilisant l'urée/ thiourée, il est indispensable de dessaler l'échantillon avant son analyse en spectrométrie de masse.
• L'alkylation qui empêche la reformation des ponts disulfures. On utilise typiquement de l'iodoacétamide à des concentrations variables (50 à 300 mM).
• La digestion qui clive les protéines en peptides. Il existe une large gamme d'enzymes disponibles, chaque enzyme se distinguant par ses sites de clivage. C'est pourquoi le choix de l'enzyme est essentiel et largement dépendant de la composition en acides aminés de la protéine étudiée. La quantité d'enzyme nécessaire est liée à la quantité de protéines présente : il est courant d'utiliser le rapport massique suivant : enzyme/protéine = 1/50. Par exemple, pour 1 μg de protéine à digérer, il faut 0,02 μg d'enzyme. La trypsine est l'une des enzymes les plus couramment utilisées pour la gamme de masses moléculaires relativement homogènes des peptides obtenus : elle clive spécifiquement du côté C-terminal des lysines et des arginines sauf s'il existe une proline adjacente.
Il peut être noté que l'hydrolyse enzymatique n'est pas l'unique technique permettant de couper une protéine en peptides, la protéine peut également être traitée chimiquement. Par exemple, il est possible d'utiliser bromure de cyanogène (CNBr) qui agit au niveau des méthionines de la structure protéique.
HAUT DE PAGE3.2 Analyse...
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Analyse et identification des protéines
BIBLIOGRAPHIE
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(2) - WILKINS (M.R.), SANCHEZ (J.C.), GOOLEY (A.A.), APPEL (R.D.), HUMPHERY-SMITH (I.), HOCHSTRASSER (D.F.), WILLIAMS (K.L.) - * - Biotechnology and Genetic Engineering Reviews, 13, p 19-50 (1995).
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