Analyse et identification des protéines
Analyse des protéines ou protéomique

3.1 Hydrolyse enzymatique des protéines

Cette étape d'hydrolyse enzymatique consiste à couper de manière contrôlée les protéines en peptides. Les protéines soumises à la digestion peuvent se trouver dans un milieu liquide ou incluses dans un gel d'électrophorèse qui sera excisé suite à la migration et détection des protéines. L'hydrolyse enzymatique est divisée en trois grandes étapes.

• La dénaturation/réduction qui permet de rompre les édifices tridimensionnels et les structures secondaires constitutives des protéines, et en particulier les ponts disulfures intra- et interprotéiques. Elle a lieu dans un milieu tamponné en présence d'agents chaotropes (trifluroéthanol 5 %, urée/thiourée 5/2 M) et d'agents réducteurs (DTT, entre 4 mM et 300 mM). En utilisant l'urée/ thiourée, il est indispensable de dessaler l'échantillon avant son analyse en spectrométrie de masse.

• L'alkylation qui empêche la reformation des ponts disulfures. On utilise typiquement de l'iodoacétamide à des concentrations variables (50 à 300 mM).

• La digestion qui clive les protéines en peptides. Il existe une large gamme d'enzymes disponibles, chaque enzyme se distinguant par ses sites de clivage. C'est pourquoi le choix de l'enzyme est essentiel et largement dépendant de la composition en acides aminés de la protéine étudiée. La quantité d'enzyme nécessaire est liée à la quantité de protéines présente : il est courant d'utiliser le rapport massique suivant : enzyme/protéine = 1/50. Par exemple, pour 1 μg de protéine à digérer, il faut 0,02 μg d'enzyme. La trypsine est l'une des enzymes les plus couramment utilisées pour la gamme de masses moléculaires relativement homogènes des peptides obtenus : elle clive spécifiquement du côté C-terminal des lysines et des arginines sauf s'il existe une proline adjacente.

Il peut être noté que l'hydrolyse enzymatique n'est pas l'unique technique permettant de couper une protéine en peptides, la protéine peut également être traitée chimiquement. Par exemple, il est possible d'utiliser bromure de cyanogène (CNBr) qui agit au niveau des méthionines de la structure protéique.